高粱液体再生系统初步研究

王良群 刘勇 郝艳芳

摘要选用幼穗为外植体并进行匀浆，将匀浆物进行振荡培养，获得颗粒状培养物。再把这些颗粒状培养物接入到液体分化培养基中，振荡培养后有些颗粒会萌发出新芽，然后把这些已长出芽的培养物接入到固体分化培养基中可获得完整的苗。研究还将幼穗固体培养模式获取的愈伤组织接入到液体分化培养基中进行振荡培养，结果获取了相互分离能生根发芽的胚状体。该研究丰富了高粱再生培养技术手段。

关键词高粱；液体再生系统；静止培养；振荡培养

中图分类号S514文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）22-0034-02

AbstractThe immature inflorescences was used as explant and homogenized.The homogenate was cultured with shaking.The granular calluslike culture was obtained and accessed into liquid differentiation edium.After further culturing， germination of sprouts will occur on some granules and then these geminated granules were added into solid regeneration culture medium.Lastly， complete seedlings can be obtained.In the study， the callus of the immature inflorescences was cultured in the liquid differentiation medium .As a result， the embryoid bodies isolated from each other were obtained.The sorghum liquid regeneration culture was explored to enrich the sorghum tissue culture technology.

Key wordsSorghum；Liquid regeneration system；Static culture；Shaking culture

植物組培是一项重要的基础生物技术，被广泛应用于工农业生产和科学技术研究等诸多行业领域。植物组培涵盖许多内容，其中组培再生系统的建立是重要的研究内容之一。由于组培再生技术对作物转基因研究应用非常重要，所以随着转基因技术快速发展，建立有效的不同作物的组培再生系统显得越来越重要。

高粱是全球第五大农作物，具有食用、饲用和酿造用等多种用途。但是与玉米等作物相比，高粱生产水平和育种水平都相对落后。造成高粱生物技术育种落后的原因很多，高粱组培再分化难从而限制高粱组培转基因研究应用是其重要原因之一[1-2]。

高粱属于较早开展离体培养技术研究的作物之一，早在1968年，就有研究者利用高粱根和分蘖节在添加2.4-D和KT的MS培养基上诱导出高粱愈伤组织。1970年，Masteller等[3]、Brettell等[4]以高粱芽原基为外植体进行了愈伤组织培养，并分化产生了再生苗。之后的多年里，国内外研究者以幼穗、幼胚、茎尖等多种器官组织为外植体进行了广泛的研究。目前，已能将幼穗、幼胚、茎尖、幼叶、成熟胚等多种外植体诱导培养出愈伤组织，且诱导率较高，在70%以上。至于再生苗分化培养，不同外植体差异较大，其中幼穗和幼胚分化率较高，其他外植体愈伤则再生出苗困难，分化率很低[5-7]。

高粱组培固体再生系统的基本流程是选取某一种外植体，消毒后接种于固体培养基上，28 d左右诱导出愈伤组织，然后转接到新固体培养基上进行21～35 d的继代培养，最后转入固体培养基进行再生苗分化培养。目前高粱组培再生普遍采用这种单一化的固体培养基再生培养模式。为了克服高粱分化难这一公认的难题，丰富高粱再生培养技术手段，近年来尝试采用高粱液体培养技术来研究高粱组培分化培养。

1材料与方法

1.1材料试验材料为高粱恢复系忻七、3642、三尺三等。

1.2幼穗等外植体取材方法该研究所用的外植体为幼穗、茎尖、成熟胚和籽粒。幼穗取材时，先从田间选取其幼穗长为1～3 cm的植株，再分3次剥出。第1次剥离在一般条件下进行，不露出幼穗，仍保留多层叶片。第2次在无菌条件下剥离，减少包埋叶片，最后用刀具剥出幼穗；制备茎尖时，先将无菌种子进行发芽，待芽长达0.5 cm，叶片展开前，即可进行茎尖截取，在无菌培养皿上把生长点或者分生区两端切去，剩余的包括生长点在内0.3～0.5 cm长的切断可用作外植体进行接种。其中成熟胚是从消毒后浸泡12 h左右的籽粒中剥取的。从发育好、发芽率高的种子中挑选出飽满的种子，灭菌后即可直接作为外植体。

1.3培养基选用

基本培养基为MS，蔗糖为3%，pH为5.8～6.0。愈伤常规诱导培养基附加的激素成分及用量主要为2，4-D 3 mg/L、KT 0.5 mg/L，继代培养基附加相同种类的激素，但含量低，一般2，4-D为1～2 mg/L、KT为0.1～0.5 mg/L，分化培养基去除2，4-D，仅用0.5 mg/L的KT。当培养基为常规固体时，加入0.8%的琼脂，不加琼脂则为液体培养基。该研究选用的几种液体培养基为 Y1（2，4-D 1 mg、KT 0.5 mg）、Y2（2，4-D 3 mg、KT 0.5 mg）、Y3（KT 0.5 mg）。

1.4静止与振荡液培方法及光温条件

液体培养分静止培养和振荡培养，静止培养就是把已接种的液体培养瓶放置在培养室的固定培养架上；振荡培养是把培养瓶置于摇床上，转速为100～150 r/min。该研究中，静止培养仅用于与振荡培养的比较试验，其余培养均为振荡培养。培养主要在安装空调的培养室进行，温度在22～25 ℃。高粱再生苗分化培养人工辅助光照强度为2 000 lx，时间为12 h，愈伤诱导和继代培养在自然光照条件下就可以。

1.5幼穗匀浆物液培方法

匀浆培养法是把幼穗等外植体进行匀浆，匀浆时加入2～3 mL液体培养基，然后直接加入Y2液体培养基中进行振荡培养。培养10 d后，如果培养物直径达3 mm，可直接将培养物接入液体分化培养基Y3中。如果培养物直径未达3 mm，则需将培养物接入到Y1或Y2中继续培养，直到培养物直径达3 mm再接入到Y3中培养，当培养物在Y3中发芽后可转接到固体分化培养基中进行培养获取完整组培苗。

1.6幼穗愈伤组织常规诱导培养与液体分化培养

愈伤组织常规培养方法是将选用的外植体接种到固体培养基上，经过28 d左右的培养，即可诱导生成愈伤组织。愈伤组织液体分化培养是把固体培养获取的愈伤组织接入到Y3液体培养基中进行振荡培养。

2结果与分析

2.1幼穗、茎尖等外植体匀浆物液培

该研究选用高粱幼穗和茎尖进行了匀浆物液培再生系统研究，结果表明茎尖相关研究无法达到预期的结果，而幼穗匀浆物液培结果超出预期。

幼穗匀浆液培研究分别选用恢复系忻七和3642进行试验。其中忻七幼穗匀浆物培养10 d后，

培养物直径未达3 mm，可能是由于匀浆力度过大导致匀浆物太细小，因而倒出上清液留下沉淀物，加入新鲜起始培养液继续培养，再培养10 d后仍发现培养物不够大，用同样的方法换培养液Y1进行继代培养，继续培养10 d后，培养物直径达3 mm，这时把沉淀物接入到含有25 mL液体分化培养基Y3三角瓶中，在摇床上振荡培养，7 d后发现有些颗粒已萌发出新芽，然后将这些已长出芽的培养物接入到固体分化培养基中置于固定不动的培养架上培养，15 d后可获得完整的苗。

高粱恢复系3642培养10 d后培养物都比较大，直径在3 mm以上，不需要继代培养。培养13 d后，直接把粒状培养物接入到25 mL液体分化培养基中，在摇床上振荡培养，10 d后发现有些颗粒已萌发出新芽，把这些已长出芽的培养物接入到固体分化培养基中置于培养架上培养，15 d后可获得完整的苗。

2.2幼穗、茎尖等愈伤组织液培

选用高粱恢复系三尺三的幼穗和茎尖进行愈伤常规培养，2种外植体都容易诱导产生愈伤组织，但二者愈伤胚性相差很大。固体常规分化培养时，茎尖愈伤很难分化产生再生苗。将茎尖愈伤接入到液体分化培养基后，只能产生许多丝状体或根状体，很难观察到发芽现象，且愈伤组织会逐渐变黑。幼穗愈伤组织胚性很好，固体分化培养效果好，容易获得再生苗，将胚性状况好的幼穗愈伤组织接入到液体分化培养基中，经过10余天的培养，会形成许多相互分离的有芽有根的独立结构，这也就是萌发了的胚状体。把这些发了芽具有胚状体结构的培养物接种到固体培养基中也可得到完整的组培苗。说明幼穗愈伤是通过胚状体途径产生再生苗的，这一现象在常规培养中是看不到的。

2.3茎尖、籽粒、成熟胚等外植体液体静止培养与振荡培养

选用高粱恢复系三尺三的茎尖、成熟胚和籽粒3種外植体进行液体静止培养与振荡培养比较试验，结果表明培养28 d后，籽粒在静止培养条件下，萌发率为8%，振荡培养条件下萌发率为80%，这和种子实际发芽率基本一致，说明静止培养对籽粒萌发有很强的抑制作用。静止培养的籽粒芽长为0.7 cm，而振荡培养的籽粒芽长为4.0 cm。另外振荡培养的籽粒能生成愈伤组织，液体中能观察到大量细胞和细胞团，而静止培养细胞较少（表1）。在对籽粒进行直接液体振荡培养时，还观察到1粒种子出8个苗的现象。

静止培养的成熟胚萌发生成不超过0.7 cm长的芽，并生成乳白色愈伤，能观察到少量细胞，振荡培养的胚芽长为1.5 cm，其愈伤为黑褐色（表2），原因可能是振荡培养时，生长快，分泌色素多，培养物衰老快。静止培养的茎尖形成的茎叶长度为4 cm左右，茎基部可观察到愈伤，液体透明，可观察到数量很少的细胞，振荡培养的茎尖则褐化死亡。

3结论与讨论

在高粱几种常用外植体中，幼穗是最适宜用于匀浆液培的，其他几种外植体不太适合。该研究结果表明，当采用同一试材时，匀浆力度大小、匀浆物粗细对培养结果（继代培养次数和时间长短）有明显的影响。与常规固体愈伤分化模式相比，外植体匀浆液培有2个优点：①培养周期明显缩短。当高粱材料3642匀浆物粗细合适时，只用30余天就得到了完整的组培苗，而常规固体愈伤再生系统一般需要60 d以上；②外植体匀浆液培系统是一种全新的再生模式，可以用于植物转基因研究中，为植物遗传转化提供一种新的试验系统，特别是在高粱被公认为分化难的情况下，多一种再生系统选择，对高粱转基因研究具有很重要的意义。幼穗匀浆液培再生系统完全不同于传统固体愈伤培养模式，该研究只是初步的探索，需要对其影响因素进行更多的研究分析，建立更加完善的技术体系。

高粱常规愈伤再生系统研究结果表明，幼穗是分化培养最适宜的外植体，其愈伤组培的胚性最好，愈伤液培结果也证明了这一点，当把幼穗、茎尖等外植体的愈伤组织块进行液体分化培养时，只有幼穗愈伤会产生相互分离的胚状体结构。该结果说明高粱幼穗愈伤分化出苗主要是通过胚状体的途径， 其意义在于这种愈伤液培方式可以用于转基因技术研究中。

由于液培时培养物完全浸没在培养基里，不像固体培养时培养物与培养基只是局部接触，所以会产生不同于常规固体培养时的效果，甚至出现意想不到的结果，可见液体培养是一种很有价值的离体培养手段。此外，通过静止与振荡液培比较试验，可以看出振荡对许多液培来说是非常必要的，振荡可以加快培养物的生长。

参考文献

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ZHU H， MUTHUKRISHNAN S，KRISHNAVENI S S， et al.Biolistic transformation of sorghum using a rice chitinasegene[J].J Genet Breed，1998，52：243-252.

[2] 朱莉，郎志宏，李桂英，等.农杆菌介导甜高粱转Bt cry1Ah的研究[J].中国农业科学，2011，44（10）：1989-1996.

[3] MASTELLER V J，HOLDEN D J.The growth of and organ formation from callus tissue of sorghum[J].Plant Physiol，1970，45（3）：362-364.

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[5] JOGESWAR G，RANADHEER D，ANJAIAH V， et al.High frequency somatic embryogenesis and regeneration in different genotypes of Sorghum bicolor（L.） Moench from immature inflorescence explants[J].In Vitro Cell Dev Biol Plant，2007，43（2）：159-166.

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