何首乌中二苯乙烯苷提取纯化研究进展

张俊娜，兰婷，王宝龙，何炜



何首乌中二苯乙烯苷提取纯化研究进展

张俊娜，兰婷，王宝龙，何炜

第四军医大学药学系，陕西西安 710032

二苯乙烯苷为何首乌的主要活性成分，具有抗衰老、神经保护、降血脂、保护肝脏、抗肿瘤等药理作用，而提取与纯化技术是其获得的关键。本文综述了近年来二苯乙烯苷的提取与纯化技术，主要包括水煎煮法、渗漉法、回流法等提取方法，以及色谱法、重结晶法、萃取法等纯化方法，并探讨其发展前景，为进一步研究及应用提供参考。

二苯乙烯苷；提取；纯化

何首乌为蓼科植物何首乌Thunb.的干燥块根，主要以生品或制何首乌入药。生首乌具有润肠、解毒功效，制何首乌则具有补肝肾、益精血、乌须发功效。何首乌的化学成分主要为蒽醌类化合物、二苯乙烯苷类化合物、磷脂类化合物等。其中二苯乙烯苷因具有多种生物活性及药理作用，已成为临床研究热点，其含量也成为何首乌药材的专属性指标。随着二苯乙烯苷临床研究的深入，其提取与纯化技术也成为该领域的研究重点。目前，二苯乙烯苷的提取与纯化方法工艺复杂、效率较低，难以实现产业化。因此，研究开发高效的提取与纯化工艺对二苯乙烯苷稳定性、药理活性及临床应用等研究的开展具有重要意义。本文综述近年来二苯乙烯苷的提取与纯化技术研究进展，以期为其开发及应用提供参考。

1 二苯乙烯苷简介

二苯乙烯苷，化学名称为2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷，分子式为C20H22O9，分子量为406.39，化学结构式见图1。其外观为白色无定形粉末，易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮等，可溶于乙酸乙脂，难溶于亲脂性有机溶剂，光照条件下反式二苯乙烯苷转化为顺式二苯乙烯苷[1]，在高温条件（＞60 ℃）、酸性溶液中很不稳定，在强酸、强碱条件下，可分别水解为葡萄糖、苷元或醌类化合物。研究表明，二苯乙烯苷具有延缓衰老[2]、保护肝脏[3]、调节血脂[4]、神经保护[5]、抗肿瘤[6]等作用。

图1 二苯乙烯苷化学结构式

2 二苯乙烯苷提取技术

2.1 水煎煮法

水煎煮法也称为“水煮法”或“水提法”，是将药材加水煎煮取汁的方法，是中药最早、最常用的制剂方法之一，适用于有效成分能溶于水、在湿和热条件下较稳定的药材，能够提取出相对较多的有效成分。张振娟等[7]、马红玉等[8]以药材粒度、浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数为考察因素，对制何首乌的水煎煮工艺进行优选，最佳工艺为：药材加10倍量水提取3次，每次1.5 h，再经分离纯化制备二苯乙烯苷。由于二苯乙烯苷对热不稳定，长时间高温操作条件下，在煎煮过程中其成分损失较大，且带来的杂质多。因此，二苯乙烯苷提取、浓缩干燥、纯化工艺应尽可能在短时间、低温条件下进行。

2.2 渗漉法

渗漉法是将粉碎的药材置渗漉筒中，由上部不断添加溶剂，溶剂渗过药材层向下流动过程中浸出药材成分的方法。渗漉法适用于有效成分遇热不稳定的中药。卢照凯等[9]开发了双组分纤维素酶前处理及渗漉提取工艺，将粉碎的何首乌原料置于渗漉罐中，加入双组分纤维素酶，从而水解、破坏何首乌细胞壁，增加细胞通透性，使二苯乙烯苷更易溶出，有利于渗漉。渗漉法提取的渗漉速度为0.8 BV/h，持续10 h，提取液通过大孔吸附树脂柱层析、重结晶等技术分离、纯化二苯乙烯苷。但渗漉法需常温下不断向粉碎中药材中添加水，消耗水量大、周期长、操作复杂。

2.3 回流法

回流法是选取合适的、易挥发的有机溶剂提取药材中有效成分，将浸出液加热蒸馏，其中挥发性溶剂馏出后又被冷却，重复流回浸出容器中浸提药材，直至有效成分回流提取完全的方法。颜世伦[10]考察了不同溶剂甲醇、乙醇等对二苯乙烯苷提取率的变化，乙醇提取效果最好。范昊宁[11]、魏宇峰等[12]研究了回流提取次数、乙醇用量、乙醇浓度、提取时间等因素对二苯乙烯苷含量的影响，发现提取次数是影响二苯乙烯苷含量的主要因素，乙醇用量次之，然后是乙醇浓度，提取时间影响最小。最佳水平工艺条件为用药材8～9倍量的60%乙醇溶液提取2～3次，每次0.5～1 h。结果表明，乙醇提取效果明显优于水提取效果，而且与渗漉法比较，回流法提取省溶剂，操作简单，可以有效缩短制备时间，从而降低成本。

2.4 超声萃取法

超声辅助萃取法是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动效应、高加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。与传统提取方法室温冷浸法、加热回流法比较，超声萃取法提取二苯乙烯苷效果更好[13]。田杰等[14]采用超声辅助、水为溶剂高效提取了何首乌中活性成分二苯乙烯苷，提取时间10 min，提取率达1.64%。在此研究基础上，邓祥等[15]通过超声波辅助乙醇提取何首乌中二苯乙烯苷，提取率高达7.19%。采用超声波振荡提取1 h即可达到回流法提取2～3 h的提取效果，进一步缩短了提取时间，提高了提取效率，且具有能耗少、操作简单、快速的优势。此外，超声萃取无需加热，可减少二苯乙烯苷的分解。因此，超声萃取法显示出较大技术优势，具有工业化前景。

2.5 微波萃取法

微波辅助萃取法是利用微波快速加热的特性，结合传统溶剂提取法而形成的一种针对固体样品成分提取的新萃取技术[16]。针对传统乙醇回流法提取何首乌中二苯乙烯苷加热时间长、消耗溶剂多的问题，王娟等[17]选用微波辅助萃取法改进何首乌提取工艺，溶剂用量减少近50%，提取时间为10 min，减少了溶剂的损耗，缩短了提取时间，有效成分含量高。在微波辅助萃取法中，传热和传质的方向均由内向外，有利于二苯乙烯苷有效物质的溶出。

2.6 超临界CO2萃取法

超临界CO2萃取法是利用超临界状态下的CO2流体做萃取剂，从液体或固体中萃取植物有效成分并进行分离的方法[18]。具提取效率高、选择性强、处理温度低、无毒、无溶剂残留、溶剂可循环，及热敏成分不易被分解破坏等优点。张伟业[19]探索了应用超临界CO2萃取法从何首乌中提取二苯乙烯苷的工艺。向文军等[20]优化了超临界CO2萃取二苯乙烯苷工艺，确定萃取压力35 MPa、温度45 ℃、萃取时间2.5 h、CO2流量12.5 L/h，得率4.64%。周暄宣[21]进一步优化了该工艺，将何首乌粉碎成粗粉（10～40目），上样于超临界CO2萃取仪的萃取釜中萃取、浓缩，萃取压力30～40 MPa、温度60 ℃，萃取时间1～3 h，必要时可采用70%～90%乙醇作为夹带剂，用量为200～400 mL/h，得萃取液，浓缩。浓缩液上样于硅胶柱层析（200～300目）纯化，用20%～80%乙醇梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，收集洗脱液，蒸除乙醇，得二苯乙烯苷粗品。二苯乙烯苷见光易分解，在高温、强碱性条件下不稳定[22-23]，而采用超临界萃取法提取二苯乙烯苷可避免以上问题。

3 二苯乙烯苷纯化技术

3.1 色谱法

3.1.1 硅胶柱色谱 硅胶柱色谱使用范围广，成本低、操作方便，可用于纯化二苯乙烯苷。王跃飞等[24]开发了一种硅胶柱色谱纯化工艺。称取二苯乙烯苷提取物，经硅胶搅拌呈松散状，置玻璃柱上面用乙酸乙酯洗脱，经薄层色谱法跟踪监测，合并含有二苯乙烯苷的流份，回收溶剂，干燥得二苯乙烯苷提取物，加纯水加热溶解二苯乙烯苷提取物后冷冻结晶，待其溶化后抽滤，纯水洗涤，可得白色结晶二苯乙烯苷纯品，纯度10%～80%的二苯乙烯苷样品均纯化至96%以上。但该法存在耗时长、溶剂消耗量大、分离效率低等缺点。

3.1.2 聚酰胺吸附色谱 聚酰胺吸附色谱属于氢键吸附色谱，系通过其分子中众多的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。因此，聚酰胺吸附色谱特别适合分离酚类、醌类和黄酮类化合物。何竞旻等[25]探索用聚酰胺柱层析法纯化何首乌中多酚羟基物质的新方法，乙醇做洗脱剂，洗脱流速1.0 mL/min，洗脱柱高70 cm，静置吸附时间20 min，其洗脱率为96.80%，但得到二苯乙烯苷纯度不高。李文[6]对该工艺进行了改进，将聚酰胺柱层析法和结晶法结合，纯化得到二苯乙烯苷晶体。该方法分离纯化二苯乙烯苷有待于进一步改进。

3.1.3 大孔树脂吸附色谱 近年来，大孔吸附树脂广泛应用于天然产物的分离，成为有机化合物尤其是水溶性化合物的有效分离手段。大孔树脂吸附色谱具有吸附量大、再生容易、可反复使用等优点。因此，该工艺用于分离纯化二苯乙烯苷的研究较深入，不同大孔树脂的绝对吸附量、吸附量、吸附率、解吸率，洗脱参数等均有报道[26-34]。上述研究表明，可用于分离纯化二苯乙烯苷的大孔树脂有DA-201、DM130、NKA-9、NKA-II、AB-8、D101、S-8、D600、HPD500、II、ZTC-1、LSA-21等，其中D101、DM130、S-8、D600、HPD500、II、ZTC-1效果较好。详见表1。

表1 不同大孔树脂分离纯化二苯乙烯苷情况

大孔树脂吸附色谱具有转移率高、成本低、操作简便、避免使用有机溶剂、安全性高等优点，适宜大规模工业化生产。

3.1.4 高速逆流色谱 高速逆流色谱是一种液液分配色谱，它利用螺旋管分离柱由行星式运动产生的变化离心力将一部分固定相固定在螺旋管中，使两相溶剂在螺旋管柱中呈单向性分布，样品随着流动相穿梭于固定相与流动相之间，样品各组分在两相间不断分配，并达到动态平衡，最终分离。佟泽勇等[35]利用高速逆流色谱法一步分离纯化二苯乙烯苷，选择正已烷-乙酸乙酯-乙醇-水（1∶50∶1∶50）的溶剂体系，得到纯度为96%的二苯乙烯苷。李瑶等[36]、尹西拳等[37]等利用高速逆流色谱法分离、纯化何首乌中的游离蒽醌和二苯乙烯苷，采用响应曲面法、优选最佳工艺，得到二苯乙烯苷纯度为99.17%。高速逆流色谱法可制备高纯度二苯乙烯苷，但其纯化效率难以提高、成本相对较高，故主要用于实验室制备。

3.2 重结晶法

重结晶法是利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同，使被提纯物质从过饱和溶液中析出，而杂质全部或大部分留在溶液中，从而达到提纯目的。采用乙醇、乙酸乙酯等溶剂对二苯乙烯苷粗品反复重结晶可得到高纯度样品，但此法易导致其分解，使收率降低。卢昶年等[38]采用常温渗漉提取二苯乙烯苷，提取液经大孔树脂分离，采用反渗透浓缩和冷冻干燥，相对低温操作，避免二苯乙烯苷分解；再向浓缩液中加入有机酸进行重结晶，一方面利用有机酸改变析晶溶液的pH值，有利于晶体析出，另一方面有机酸还能较好地保护二苯乙烯苷，避免其被破坏。该法大大提高了收率，而且可获得高纯度二苯乙烯苷。

3.3 萃取法

萃取法是利用提取物中各成分在2种互不相溶的溶剂中分配系数不同达到分离的方法，萃取时组分在两相溶剂中的分配系数越大则分离效率越高、分离效果越好。根据二苯乙烯苷的结构性质，本课题组开发了一种二苯乙烯苷的分离纯化工艺，超声提取、化学萃取和重结晶相结合的方法提取纯化何首乌中二苯乙烯苷[39]。该工艺在纯化过程中将二苯乙烯苷经化学转变成盐，在水中溶解性好且稳定，再用有机溶剂萃取除去大部分杂质，操作简便快捷，提取率高，可获得纯度高达99%的二苯乙烯苷。

4 结语

近年来，随着对二苯乙烯苷延缓衰老、保护肝脏、保护神经、调节血脂、抗肿瘤等药理作用及临床研究的深入，对高品质二苯乙烯苷需求不断增长，而二苯乙烯苷的提取、纯化已成为研究的热点。为了提高二苯乙烯苷的提取与纯化工艺，笔者认为应大力开展超临界CO2萃取等新技术的研究和开发，使二苯乙烯苷的提取与纯化工艺向高效、绿色、低成本方向发展，同时，注重多种技术组合、联合使用，不断完善提取与纯化技术，使其向着规模化工业生产的方向发展。

[1] 郭志烨,韩丽,杨明,等.制何首乌中二苯乙烯苷对光和热的不稳定性[J].中成药,2014,36(11)：2280-2285.

[2] 贾朝.商洛何首乌提取物的抗氧化活性研究[J].商洛学院学报,2014, 28(4)：15-18.

[3] 俞捷,林佩,陆建美,等.何首乌活性成分二苯乙烯苷对肝细胞脂质合成、分解及转运的调节作用研究[J].中国药学杂志,2014,49(23)：2077- 2082.

[4] 董立华.二苯乙烯苷顺反异构体的降血脂作用、药动学与组织分布对比研究[D].石家庄：河北医科大学,2014.

[5] ZHAO J, LIANG Y, SONG F, et al. TSG attenuates LPC-induced endothelial cells inflammatory damage through notch signaling inhibition[J]. International Union of Biochemistry and Molecular Biology,2016,68(1)：37-50.

[6] 李文.广西生何首乌天然小分子化合物的提取分离及抗肿瘤活性筛选[D].南宁：广西医科大学,2010.

[7] 张振娟,刘代华,梁建成,等.正交试验优选制首乌水煎煮工艺[J].中国医药导报,2013,10(15)：146-148.

[8] 马红玉,章军,陈莎,等.动态优化方法在何首乌提取工艺优化中应用研究[J].海峡药学,2015,27(3)：52-55.

[9] 卢照凯,卢昶年,周晓青,等.高效提取高纯度何首乌二苯乙烯苷的新工艺[J].企业科技与发展,2012(11)：32-33.

[10] 颜世伦.制何首乌的化学成分研究[D].天津：天津大学,2014.

[11] 范昊宁.制何首乌药材及制剂质量标准研究[D].咸阳：陕西中医学院,2010.

[12] 魏宇峰,周国儿.人参首乌胶囊制备工艺的研究[J].中国生化药物杂志,2014,34(3)：169-171.

[13] 张旭.硫脲类催化剂催化不对称Aza-Henry反应研究和四羟基二苯乙烯苷提取纯化工艺研究[D].西安：第四军医大学,2012.

[14] 田杰,焦钰.何首乌中二苯乙烯苷的提取[J].科技风,2015(15)：177.

[15] 邓祥,黄小梅,吴狄.何首乌中二苯乙烯苷类物质的超声波提取工艺优化[J].应用化工,2015,44(3)：453-455.

[16] 吴龙琴,李克.微波萃取原理及其在中草药有效成分提取中的应用[J].中国药业,2012,21(12)：110-112.

[17] 王娟,沈平,沈永嘉.均匀设计优选微波辅助萃取何首乌中有效成分的研究[J].中草药,2010,34(4)：314-317.

[18] 姜欣欣,李跃金,陈维.超临界CO2萃取技术在中药有效成分提取中的应用[J].广东化工,2015,42(1)：53-54.

[19] 张伟业.何首乌提取工艺研究[J].中国实用医药,2011,6(6)：57-58.

[20] 向文军,黄宇,邓双强.超临界CO2萃取何首乌中二苯乙烯苷的研究[J].应用化工,2015,44(9)：1659-1660.

[21] 周暄宣.高纯度二苯乙烯苷制备工艺及其抗衰老机制研究[D].西安：第四军医大学,2013.

[22] 林冰,江国秀,王莹,等.何首乌提取液对氧气的稳定性研究[J].中成药,2013,35(8)：1664-1667.

[23] 李瑞煜,冯五文,李晓菲,等.金属离子对何首乌中二苯乙烯苷稳定性的影响[J].药学学报,2016,51(1)：116-121.

[24] 王跃飞,高秀梅,朱彦,等.2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的分离纯化工艺：CN201310350567.7[P].2013-08-22.

[25] 何竞旻,黄劲松,陈从贵.聚酰胺吸附法分离纯化何首乌中二苯乙烯苷的研究[J].农产品加工,2009(11)：13-16.

[26] 汪杰,曹骋.DM-130大孔吸附树脂纯化何首乌中二苯乙烯苷的工艺研究[J].中国现代中药,2013,15(7)：590-593.

[27] 崔莉,陈静娴,朱姮,等.何首乌中顺式和反式-二苯乙烯苷对照品的制备[J].山东科学,2015,28(6)：6-10.

[28] 曹骋,贾薇,王术玲,等.LSA-21型大孔吸附树脂富集何首乌中二苯乙烯的工艺研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(10)：50-53.

[29] 林飞,郑浩,路巧红,等.何首乌中二苯乙烯苷与总蒽醌的提取与分离[J].河南中医,2011,31(10)：1191-1192.

[30] 陈伟,李霞,郑友兰,等.何首乌二苯乙烯苷大孔树脂纯化工艺优化[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(5)：40-43.

[31] 李春英,刘廷辉,岳建明,等.何首乌杀虫活性成分的分离纯化及初步鉴定[J].河北农业大学学报,2014,37(6)：62-66.

[32] 曾姚,肖潇,于海,等.何首乌中活性成份的提取及乌发洗发水的配制[J].科技风,2015(15)：39.

[33] 高淑红,苏珍枝,吴士杰,等.制首乌化学成分的研究[J].时珍国医国药,2013,24(3)：543-545.

[34] 周莹,刘广锋,冯娟,等.何首乌3种组分的提取及其清除DPPH自由基作用的研究[J].广东药学院学报,2014,30(3)：301-304.

[35] 佟泽勇,宋媛媛.高速逆流色谱法一步分离何首乌中的二苯乙烯苷[J].黑龙江科技信息,2011(25)：23.

[36] 李瑶,管淑玉,李将,等.从何首乌制备高纯度二苯乙烯苷的分离纯化方法[J].中国现代中药,2015,17(4)：391-394.

[37] 尹西拳,桂蜀华,万玉华,等.高速逆流色谱法分离何首乌中的游离蒽醌及二苯乙烯苷[J].中药材,2014,37(2)：328-332.

[38] 卢昶年,卢照凯.从何首乌中提取二苯乙烯苷的方法：CN201010133955.6[P].2010-03-26.

[39] 何炜,张旭,王四旺,等.一种四羟基二苯乙烯苷的分离纯化工艺：CN201210136568.7[P].2012-05-06.

Research Progress in Extraction and Purification of Stilbene Glucoside from Polygoni Multiflori Radix

ZHANG Jun-na, LAN Ting, WANG Bao-long, HE Wei

Stilbene glucoside is one of major active constitutions in Polygoni Multiflori Radix. Stilbene glucoside contributed markedly to resisting caducity, protecting nerve, reducing serum lipids, and protecting liver and antitumor activity. The extraction and purification technology is the key issue to obtain stilbene glucoside. Through research, extraction and purification technology has made a certain progress. The stilbene glycoside could be extracted by water boiling, diacolation, and backflow; then it could be purified by the method of chromatography, recrystallization, and extraction. In this article, the technologies in extracting and purifying stilbene glucoside were reviewed, and the prospect of stilbene glucoside preparation was discussed to lay the foundation for further research and application.

stilbene glucoside; extraction; purification

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.034

R284.2

A

1005-5304(2017)07-0133-04

陕西省科技统筹计划重点项目（2012KTCQ0302）

何炜，E-mail：weihechem@fmmu.edu.cn

（2016-05-11）

（2016-06-05；编辑：向宇雁）