武夷岩茶加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表达与香气前体物质的差异性

陈寿松, 邓慧莉,2, 何水平, 周子维, 邓婷婷, 孙 云, 赖钟雄(.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2.闽江师范高等专科学校公共基础部，福建 福州 35008)

武夷岩茶加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表达与香气前体物质的差异性

陈寿松1, 邓慧莉1,2, 何水平1, 周子维1, 邓婷婷1, 孙 云1, 赖钟雄1
(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2.闽江师范高等专科学校公共基础部，福建 福州 350108)

研究水仙和肉桂2种武夷岩茶加工过程中糖苷类香气前体物质的变化以及β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表达的差异性.结果表明：肉桂香气前体物质总量是水仙的0.80～1.93倍，香气前体物质总量变化具有差异性；水仙β-樱草糖苷酶基因平均相对表达量(1.10)低于β-葡萄糖苷酶基因(1.90)，晒青过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量显著高于鲜叶，做青过程中的变化未达到显著水平；肉桂β-樱草糖苷酶基因的平均相对表达量(0.54)低于β-葡萄糖苷酶基因(0.76)，晒青过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量与鲜叶比较未达到显著水平，做青结束后达到显著水平.水仙2个基因和肉桂β-樱草糖苷酶基因的相对表达量与香气前体物质总量及各糖苷成分含量变化总体一致.

武夷岩茶; 糖苷类香气前体物质; β-樱草糖苷酶; β-葡萄糖苷酶; 基因相对表达量

Abstract: To investigate the molecular mechanism of aromatic compound formation in Wuyi rock tea, differential expression of glycosidic aroma precursors,β-primeverosidaseandβ-glucosidasegenes were analyzed in Shuixian and Rougui manufacturing process. The results indicated that total amount of aroma precursors of Rougui was 0.80-1.93 times as high as that of Shuixian, and they varied significantly during manufacturing process. Averagely, relative expression ofβ-primeverosidasegene (1.10) was less thanβ-glucosidase(1.90) for Shuixian. During sun-withering process, relative expressions ofβ-primeverosidaseandβ-glucosidasegenes increased significantly compared with fresh leaves, and their difference did not reach significant level in tea leaf shaking stage. In Rougui, relative expression ofβ-primeverosidasegene (0.54) was less thanβ-glucosidase(0.76). Relative expressions ofβ-primeverosidaseandβ-glucosidasegenes did not change much compared with those of fresh leaves, but they rised significantly in tea leaf shaking stage. Changes in gene expressions ofβ-primeverosidaseandβ-glucosidasein Shuixian andβ-glucosidasein Rougui showed the same trend with glycosidic aroma precursors.

Keywords: Wuyi rock tea; glycosidic aroma precursors; β-primeverosidase; β-glucosidase; gene expression

香气是判别茶叶品质的重要指标之一.研究表明，β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶与茶叶香气的释放密切相关，能够水解糖苷类香气前体物质并释放醇系香气[1-2].廖淑娟[1]研究表明，不同茶树品种的糖苷类香气前体物质种类和含量差异显著.

目前，对香气相关重要酶类的研究已从分离纯化[1-2]、加工过程中的变化规律[2]及分析不同种质资源间的差异[2]等生理生化水平逐步向分子水平发展[3-5].已有研究表明，β-葡萄糖苷酶基因的表达量远远高于β-樱草糖苷酶基因[6]，短时间紫外线处理可以使β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的活性增强[7].经过茉莉酸甲酯处理的茶树，β-樱草糖苷酶基因的表达水平提高3倍[8].

乌龙茶滋味醇厚、花香馥郁，武夷岩茶以其独特的“岩骨花香”成为乌龙茶中的佼佼者.而前人对武夷岩茶香气的研究基本停留在组分测定阶段，由此开展武夷岩茶香气形成的分子生物学研究具有十分重要的现实指导意义.本试验对茶叶糖苷类香气前体物质在加工过程中的变化规律进行研究，并通过实时荧光定量PCR技术，对β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因在水仙和肉桂2种武夷岩茶加工中的表达进行定量分析[9-13]，以揭示茶叶香气形成的分子机理，为研制香型独特持久的茶叶产品提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料来源 以武夷山市上梅乡的春季水仙和肉桂品种为供试材料，鲜叶采摘标准为开面三、四叶.

糖苷类香气前体物质试验的取样：选取原料相对一致的开面三叶，采用烘箱固样法进行固样.试验样品编号及名称见表1.

实时荧光定量PCR试验的取样：选取原料相对一致的成熟二叶，采用液氮固样法进行固样.试验样品编号及名称见表1.

表1 试验样品编号及名称Table 1 Sample numbers and names

1.1.2 试剂与仪器 糖苷类香气前体物质试验：7890A气相色谱—质谱联用仪(美国安捷伦科技公司)、旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)、高速冷冻离心机(上海拜力生物科技有限公司)等.

实时荧光定量PCR试验：RNAprep Pure Plant Kit(天根生化科技有限公司)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Perfect Rerl Time(TaKaRa公司)、Lighe-Cycler 480 System(罗氏公司).

1.2 糖苷类香气前体物质的测定与香气成分的定性定量测定

糖苷类香气前体物质的测定：采用沸乙醇—双相酶解法[3].

香气成分的定性定量测定：香气物质采用标准样定性，以癸酸乙酯作内标，采用内标校正曲线法定量.

1.3 总RNA的提取与cDNA的合成

采用RNAprep Pure Plant Kit试剂盒说明书的方法提取总RNA.采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Perfect Real Time试剂盒说明书进行cDNA的合成.

1.4 实时荧光定量PCR扩增

参照孙云[14]的方法，根据试验材料的特点作部分改进.

以茶树18S rRNA为内参基因，检测水仙、肉桂加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因相对表达量的差异性，引物序列如表2所示.

根据表2的引物设计，以XY-S和XY-R作对照，其基因的表达量定义为1个单位，采用2-△△Ct法计算相对表达量.

2 结果与分析

2.1 水仙和肉桂加工过程中糖苷类香气前体物质的变化

在水仙和肉桂加工过程中提取的香气前体物质通过酶解释放出来的成分有顺-3-己烯醇、芳樟醇、水杨酸甲酯、香叶醇、苯甲醇等5种物质，表明水仙和肉桂含有上述相应的5种香气前体物质，其变化如表3、4所示.肉桂糖苷类香气前体物质的总量是水仙的0.80～1.93倍.水仙糖苷类香气前体物质总量的平均值(22.15 μg·g-1)低于肉桂(27.66 μg·g-1).加工过程中水仙和肉桂糖苷类香气前体物质总量的变化规律具有差异性：晒青过程中糖苷类香气前体物质总量均上升，做青过程中总体均呈下降趋势；揉捻过程中糖苷类香气前体物质的总量呈此消彼长的关系，水仙变化幅度大于肉桂；干燥过程中糖苷类香气前体物质的总量均下降，水仙下降幅度较大.

表2 β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表达的实时荧光定量PCR引物序列Table 2 RT-PCR primer sequences for β-primeverosidase and β-glucosidase genes

表3 水仙加工过程中糖苷类香气前体物质总量及各成分含量的变化Table 3 Changes in total glycosidic aroma precursors amount and component content in Shuixian μg·g-1

表4 肉桂加工过程中糖苷类香气前体物质总量及各成分含量的变化Table 4 Changes in total glycosidic aroma precursors amount and component content in Rougui μg·g-1

表3、4显示，水仙和肉桂糖苷类香气前体物质的组分不存在明显差异，均由脂肪醇、萜烯醇、芳香醇和酯类糖苷组成，且以萜烯醇糖苷为主.水仙和肉桂糖苷类香气前体物质组分相对含量的大小均为：萜烯醇糖苷>芳香醇糖苷>酯类糖苷>脂肪醇糖苷，但各组分的相对含量存在差异，水仙的萜烯醇和酯类糖苷总体上高于肉桂，而脂肪醇和芳香醇糖苷则低于肉桂.

水仙加工过程中香气前体物质平均含量的大小为：香叶醇糖苷>苯甲醇糖苷>水杨酸甲酯糖苷>芳樟醇糖苷>顺-3-己烯醇糖苷；肉桂为：香叶醇糖苷>苯甲醇糖苷>芳樟醇糖苷>水杨酸甲酯糖苷>顺-3-己烯醇糖苷.水仙加工过程中香叶醇、苯甲醇、水杨酸甲酯、芳樟醇和顺-3-己烯醇糖苷的含量分别是肉桂的0.40～1.47、0.26～1.07、0.46～2.59、0.40～1.47和0.06～1.88倍，平均含量分别是肉桂的0.89、0.62、1.30、0.59和0.23倍，2个品种糖苷类香气前体物质含量的最高值和最低值均为香叶醇和顺-3-己烯醇糖苷，各成分在加工过程中的变化趋势存在差异.

2.2 水仙加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因相对表达量的差异

以XY-S作对照，对水仙各工序β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量进行半定量分析，结果如图1所示.

随着加工工序的变化，水仙加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量整体呈先升后降的变化趋势.晒青阶段两者显著增加，均在WD-S阶段达到相同最高值(2.48)；做青前期，WD-S至YQ-2-S阶段的相对表达量均高于鲜叶，做青后期相对表达量逐渐降低，均在做青结束后达到最低值，β-樱草糖苷酶基因的平均相对表达量(1.10)低于β-葡萄糖苷酶基因(1.19)；晒青过程中两者的相对表达量显著高于鲜叶(P<0.05)；做青YQ-1-S阶段β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量较萎凋叶均达到显著水平(P<0.05)，做青结束后两者变化均未达到显著水平；加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量仅在YQ-1-S阶段差异达到显著水平(P<0.05).

图1 水仙加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量Fig.1 Relative expression of β-primeverosidase and β-glucosidase gene in Shuixian

2.3 肉桂加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因相对表达量的差异

肉桂加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因相对表达量的差异如图2所示.

图2 肉桂加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量Fig.2 Relative expression of β-primeverosidase and β-glucosidase gene in Rougui

随着加工工序的变化，β-樱草糖苷酶基因的相对表达量整体呈波动的下降趋势，晒青过程中该基因的平均相对表达量为0.54，相对表达量升高且在WD-R阶段达到最高值(1.11)；做青前期WD-R至YQ-4-R阶段呈“U”型变化趋势，在YQ-2-R阶段达到坡底(0.44)；做青后期YQ-4-R至ZQ-R阶段相对表达量明显下降，至ZQ-R阶段达到整个加工过程的最低值.晒青过程中β-樱草糖苷酶基因的相对表达量与鲜叶比较未达到显著水平，做青YQ-6-R阶段显著低于鲜叶(P<0.05)，做青结束后较鲜叶差异达到显著水平(P<0.05).

β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量整体呈波动的下降趋势，平均相对表达量为0.76，晒青过程中该基因的相对表达量降低，做青前期呈“M”型的变化趋势，在YQ-1-R和YQ-3-R阶段达到整个做青过程的2个峰值(1.11和1.16)，超过鲜叶的相对表达量；做青后期相对表达量逐渐下降，至做青结束后达到整个加工过程的最低值(0.23).晒青过程中，β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量与鲜叶比较未达到极显著水平，做青过程YQ-2-R和YQ-6-R阶段的相对表达量与鲜叶的差异显著(P<0.05)，做青结束后的相对表达量与XY-R的差异达到显著水平(P<0.05).

肉桂加工过程中各阶段β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因相对表达量的差异均未达到显著水平.

3 讨论

3.1 水仙和肉桂加工过程中糖苷类香气前体物质的差异

本试验结果表明：水仙和肉桂的鲜叶经过萎凋后，糖苷类香气前体物质总量显著增加，这与前人的研究结果[15-16]一致.其中，顺-3-己烯醇、芳樟醇糖苷增幅较明显，其他成分增幅不明显，说明利用加工过程香气前体物质的化学反应，适当调节萎凋程度可以提高糖苷总量.

随着做青工序的进行，糖苷类香气前体物质总量较萎凋叶有所减少，这与前人的研究结果[16-17]一致，且香气前体物质呈波动变化特点，说明做青过程存在糖苷合成与酶解的动态平衡.做青中期其他糖苷成分含量均有所下降，而苯甲醇含量继续上升，这可能是随着加工的进行，叶片中仍存在苯甲醇糖苷的合成，本试验结果与赵飞的研究结果[15]相似，即某些糖苷类香气前体物质是在加工后期才逐步形成的.水仙和肉桂糖苷类香气前体物质苷元组成虽然完全相同，但在含量上差异明显，这可能是造成水仙和肉桂品质差异的原因.

3.2 水仙、肉桂β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因相对表达量的差异

本试验结果表明：水仙在加工过程中，β-樱草糖苷酶基因的平均相对表达量低于β-葡萄糖苷酶基因；晒青过程中两者的相对表达量与鲜叶比较均达到显著水平，做青过程的变化未达到显著水平.肉桂在加工过程中，β-樱草糖苷酶基因的相对表达量在萎凋结束后未达到显著水平，做青结束后与鲜叶的差异达到显著水平；β-葡萄糖苷酶基因在做青过程各阶段的相对表达量与鲜叶的差异不显著，做青结束后与鲜叶的差异达到显著水平.赵丽萍等[18]研究表明，β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量明显高于β-樱草糖苷酶，这与本试验结果相一致.

本试验结果表明：水仙β-樱草糖苷酶基因在各工序中的相对表达量均高于肉桂，并分别在WD、YQ-1、YQ-2阶段差异达到极显著水平；水仙β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量总体上高于肉桂，β-葡萄糖苷酶基因分别在WD、YQ-1、YQ-2阶段差异达到极显著水平.

晒青阶段β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量显著升高，是由于茶叶叶片水分散失引起水分胁迫.做青阶段相对表达量呈波动变化是由于β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶属于香气形成的水解酶，两者兼具抗性酶作用，摇青的动力胁迫启动基因表达机制，相对表达量升高，在摊青阶段茶叶静置，无外力胁迫作用，基因表达量的变化主要由内部机制变化引起，可能是细胞活性降低引起基因相对表达量降低.赵丽萍等[18]研究表明，随着茶树叶龄的增加，β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量降低，且β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量远远高于β-樱草糖苷酶基因.本试验供试原料标准为开面三、四叶，因此，水仙和肉桂β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量均高于β-樱草糖苷酶基因.

3.3 水仙、肉桂β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因相对表达量与糖苷类香气前体物质变化的相关性

水仙β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因定量表达与糖苷类香气前体物质的关系表现为：整个加工过程中β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量与糖苷类香气前体物质总量及所检出的糖苷成分变化总体一致，总体变化特点与β-葡萄糖苷酶和糖苷类香气前体物质的关系基本相同.说明水仙在加工过程中，β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因间接调控β-葡萄糖苷酶活性的变化，最终引起糖苷类香气前体物质的相应变化.

肉桂β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因定量表达与糖苷类香气前体物质的关系表现为：β-樱草糖苷酶基因定量表达与糖苷类香气前体物质总量及所检出的糖苷成分含量变化趋势一致，晒青结束后含量均增加，这是由于β-樱草糖苷酶定位在细胞壁和细胞间腔区，糖苷类香气前体物质存在于液泡中，晒青过程中叶片细胞没有受到严重的机械损伤，未能使香气前体物质与酶发生反应.但β-葡萄糖苷酶基因的定量表达与糖苷类香气前体物质变化略有差异，晒青过程中β-葡萄糖苷酶基因的相对表达量下降而糖苷类香气前体物质总量及所检出的糖苷成分含量均增加，是晒青阶段香气前体物质大量水解生成香气成分造成的，做青阶段基因的相对表达量与香气前体物质的变化趋势总体一致.

本研究进一步明确武夷岩茶加工过程中β-樱草糖苷酶、β-葡萄糖苷酶基因与糖苷类香气前体物质的相关性，为进一步研究基因、酶与香气前体物质协同调控形成武夷岩茶的特征香气提供参考；且在逐渐掌握β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶酶学特性的过程中，分析不同品种间香气相关基因表达差异的结果，为加工技术调控、提高茶叶品质提供参考依据.

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(责任编辑:施晓棠)

Differentialgeneexpressionanalysisofβ-primeverosidaseandβ-glucosidasegenesandaromaprecursorsinWuyirockteamachiningprocess

CHEN Shousong1, DENG Huili1,2, HE Shuiping1, ZHOU Ziwei1, DENG Tingting1, SUN Yun1, LAI Zhongxiong1
(1.College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Public Basic Department, Minjiang Teachers College, Fuzhou, Fujian 350108, China)

S571.1

A

1671-5470(2017)05-0502-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.004

2017-03-16

2017-05-23

国家现代农业(茶叶)产业技术体系建设专项资金项目(CARS-19)；“十二五”国家科技支撑计划项目(2014BAD06B06)；福建茶产业农技推广服务试点建设项目(KNJ-151000).

陈寿松(1987-)，男，博士研究生.研究方向：茶叶加工与加工工程.Email：css7788531@163.com.通讯作者孙云(1964-)，女，教授，博士生导师，博士.研究方向：茶叶加工与品质.Email:sunyun1125@126.com.