五氯酚对好氧活性污泥中不同酶活性的影响

汪灵伟，汪皓琦，刑一明，董玉瑛，邹学军，张瑾刚

(1.大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116605；2.美国康宁公司 生命科学部，美国 波士顿 01801 )

五氯酚对好氧活性污泥中不同酶活性的影响

汪灵伟1，汪皓琦1，刑一明1，董玉瑛1，邹学军1，张瑾刚2

(1.大连民族大学 环境与资源学院，辽宁 大连 116605；2.美国康宁公司 生命科学部，美国 波士顿 01801 )

以五氯酚为研究对象，采用分光光度法测定其对城市污水处理厂好氧活性污泥中的脲酶、转化酶、脱氢酶活性的影响。结果表明，随着五氯酚暴露浓度的增大，脲酶活性总体呈上升趋势；转化酶活性先升高后降低，暴露时间为0.5 h，转化酶升高率达到最大值49.3%；暴露15 h后转化酶活性开始呈现降低态势，实验最大暴露时间25 h时降低率达到76.8%。脱氢酶活性则大多呈现降低趋势，在暴露0.5 h时其酶活性随五氯酚浓度变化呈明显负相关，酶活性降低率为52%，之后脱氢酶活性被抑制情况呈现平缓趋势。综合生理生化反应指标的敏感度和分析方法的精密度进行评价，五氯酚对转化酶影响幅度大且分析精密度高，而脱氢酶响应快，可作为急性毒性应激敏感指标。

五氯酚；好氧活性污泥；脲酶；转化酶；脱氢酶

Abstract:Taking pentachlorophenol as the research object, its effects on urease, invertase and dehydrogenase activities in aerobic activated sludge from the municipal sewage plant were measured using spectrophotometry. The results demonstrated that with the increase of the exposure concentration of pentachlorophenol, urease activity overall was increased, while invertase activity was increased, followed by a decrease. The invertase was increased by 49.3% at 0.5 hours of exposure, and decreased at 15 hours, whose inhibition rate reached to 76.8% at 25 hours. The dehydrogenase activity was initially decreased clearly and then remained inhibiting slowly. The dehydrogenase activity was negatively correlated with increasing pentachlorophenol concentrations and the dehydrogenase activity was decreased by 52% within 0.5 hours of exposure. Based on evaluation of sensitivity of physiological and biochemical reactions and precision of analytical method, we observed high analytical precision of robust effect of invertase and rapid response of dehydrogenase to pentachlorophenol. Therefore, these two enzymes can be used as acute toxicity stress sensitive indicators.

Keywords:pentachlorophenol; aerobic activated sludge; urease; invertase; dehydrogenase

新兴污染物是一种以低微浓度就能影响生物生存或抑制生物机能的化学物质，这类污染物来源广、排放量大，造成其在环境中长期存在。抗生素、抗炎药、消毒剂、除草杀虫用剂等药品和个人护理品PPCPs(Parmaceuticals and Personal Care Products)是与人类关系密切、应用广泛、种类繁多的一大类新兴污染物[1]。受限于新兴污染物的处理技术和效率，这些物质将进入污水处理厂、受纳水体和饮用水源地，甚至水管水。抗生素、化肥农药、产品添加剂等类型的新兴污染物进入污水处理厂，可能对污水处理厂活性污泥中的微生物活性产生抑制作用，甚至导致其死亡，从而影响污水处理效果的稳定性和出水水质。有关PPCPs对活性污泥中微生物抑制情况的研究备受关注。

五氯酚是一种常见的易电离、难溶于水的氯代芳香族有机污染物，自20世纪30年代以来，五氯酚及其钠盐在全球范围内被广泛用作杀菌剂、除草剂、杀虫剂和木材防腐剂[2]。目前，国内外的研究多集中于五氯酚在污水处理厂中的降解效率、代谢产物及其毒性减排的情况，而对城市污水处理厂污泥活性影响的研究较少[3-5]。本文以五氯酚为研究对象，测定了其对好氧活性污泥中脲酶、转化酶、脱氢酶活性的影响，为新兴污染物生物处理工艺设备的运行维护和合理调控奠定了基础[6-8]。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

UV-1000分光光度计(上海美普达仪器有限公司)；TDZ5-WSD多管架自动平衡离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；THZ-B台式恒温振荡器(常州诺基仪器有限公司)；PHP-9082型电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；溶解氧测定仪(北京哈纳科仪科技有限公司)。

甲苯、10%尿素溶液、柠檬酸缓冲溶液(pH 6.7)、1%次氯酸钠；磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(pH 5.5)、10%蔗糖基质溶液、3,5-二硝基水杨酸溶液、甲醛、丙酮、硫化钠、2,3,5-氯化三苯基四氮唑、三羟甲基氨基甲烷等试剂均为分析纯。实验中所用活性污泥均取自大连某污水处理厂的曝气池，其接纳污水中大部分是生活污水。曝气池中污泥混合液悬浮固体(MLSS)质量浓度为3 000 mg·L-1,挥发性悬浮物(VSS)约为0.7 mg·L-1，污泥容积指数(SVI)在80～120 mg·g-1。

1.2 脲酶的测定方法

应用苯酚钠比色法，将污泥悬浊液与适量甲苯充分混合，加入10%尿素溶液和柠檬酸缓冲溶液，置于37 ℃恒温培养箱中培养。取出后将混合液过滤。取适量滤液依次加入一定量苯酚钠和次氯酸钠。将混合液混匀后静置显色，溶液呈现靛蓝色。稀释后在578 nm下测其吸光度。以24 h后1 g活性污泥中NH3-N的毫克数表示脲酶活性(Ure):

(1)

式中，a为样品吸光度值对应标准曲线求得的NH3-N毫克数；v为显色液体积；n为分取倍数，浸出液体积/吸取滤液体积；m为烘干土种的质量(g)。

1.3 转化酶的测定方法

应用3,5-二硝基水杨酸法，取一定量的污泥悬液加入适量磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，10%蔗糖基质溶液和少量甲苯溶液，将此混合液置于恒温培养箱中培养。过滤后取少量滤液，加入适量3,5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴锅中加热，冷却，稀释后在540 nm下测吸光度值。转化酶活性(Invert)以1 g烘干污泥24 h生成葡萄糖毫克数表示。

(2)

式中，a表示其由标准曲线求得的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m为烘干土样。

1.4 脱氢酶的测定方法

DHA=A×B×C。

(3)

式中，A为标准曲线上查得TTC浓度；B为培养矫正时间；C为稀释倍数。

1.5 实验质量控制

为了减少实验过程中酶活性的自然衰减对实验产生的影响，实验过程中控制活性污泥中酶活性的自然衰减率在15%范围内，确定实验的暴露时间为0～25 h。五氯酚在环境中的最大暴露浓度为120 mg·L-1，确定实验过程中五氯酚的暴露浓度梯度范围为0～120 mg·L-1。

2 结果与讨论

2.1 五氯酚对脲酶活性的影响

测定不同条件下污泥溶液吸光度的变化，求得脲酶活性。不同时间下，受五氯酚胁迫的活性污泥中脲酶活性变化情况如图1。

图1 不同五氯酚浓度梯度胁迫下脲酶活性动力学变化情况

在相同时间条件下，好氧活性污泥中脲酶的活性随五氯酚浓度的升高总体呈上升趋势，五氯酚浓度在0～120mg·L-1范围内，脲酶活性最大上升率为41.4%，最小上升率为16.9%。脲酶是一种水解酶，活性污泥对污染物的降解很大程度上依赖其中的水解酶[9-10]，当污染物进入城市污水厂，活性污泥中水解酶活性上升。随着暴露时间的不断延长，相同五氯酚暴露浓度下，好氧活性污泥中脲酶活性变化不大。

2.2 五氯酚对转化酶活性的影响

测定不同条件下污泥溶液吸光度的变化，求得转化酶活性。不同时间下，受五氯酚的胁迫，活性污泥中转化酶活性变化情况如图2。

图2 不同五氯酚浓度梯度胁迫下转化酶活性动力学变化情况

活性污泥与五氯酚暴露0.5 h时，转化酶活性随五氯酚浓度的增大呈现出明显的上升趋势，变化曲线如图3。

图3 0.5 h转化酶活性随五氯酚浓度变化曲线

上升率最大值为84%。污染物中微生物的一种自我保护机制[11]可能会造成活性污泥中转化酶的应激反应。

随暴露时间的不断延长，转化酶活性的升高率逐渐降低，暴露时间15～25 h，转化酶活性呈现出降低趋势，变化曲线如图4。

图4 25 h转化酶活性随五氯酚浓度变化曲线

暴露时间为25 h降低率达到了最大值77%。可能原因是五氯酚的存在影响了微生物的代谢过程，超出了其承受范围，导致自身活性下降。相同暴露浓度下，转化酶对五氯酚暴露时间的改变很敏感，随培养时间的延长，转化酶活性呈现明显的降低趋势。综合生理生化反应指标的敏感度和分析方法的精密度进行评价，五氯酚对转化酶影响幅度大且分析精密度高。

2.3 五氯酚对脱氢酶的影响

测定不同条件下污泥溶液吸光度的变化，求得脱氢酶活性。不同时间下，受五氯酚的胁迫活性污泥中脱氢酶活性变化情况如图5。

图5 不同五氯酚浓度梯度胁迫下脱氢酶活性动力学变化情况

活性污泥与五氯酚暴露时间为0.5 h，脱氢酶活性随五氯酚浓度变化呈负相关，变化曲线如图6。

图6 五氯酚不同浓度梯度下暴露0.5h脱氢酶活性变化曲线

脱氢酶活性降低率为52%，脱氢酶活性变化范围较大；0.5 h后，脱氢酶活性逐渐恢复，随五氯酚浓度的升高变化幅度减小，脱氢酶属于急性毒性应激敏感指标。

3 结 论

(1) 五氯酚浓度影响了活性污泥中脲酶、转化酶和脱氢酶的活性。随着暴露浓度的增大，脲酶活性升高，转化酶活性先升高后降低，脱氢酶活性先降低后保持平稳。

(2) 暴露时间对脲酶、脱氢酶活性影响较小，对转化酶活性影响较大。综合生理生化反应指标的敏感度和分析方法的精密度进行评价，五氯酚对转化酶影响幅度大且分析精密度高，而脱氢酶响应快，可作为急性毒性应激敏感指标。

(3) 五氯酚的存在导致污水处理厂活性污泥中微生物活性受到抑制，酶活性受到不同程度的影响，将影响城市污水处理厂的出水水质。

[1] 杨程. 城市水系統中PPCPs分布及污水处理优化研究[D]. 重庆：重庆大学, 2014.

[2] 王旭刚, 孙丽蓉. 五氯酚的污染现状及其转化研究进展[J]. 环境科学与技术, 2009, 32(8):93-100.

[3] HE H, CHEN Y, LI X, et al. Influence of salinity on microorganisms in activated sludge processes: A review[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2016,1(8):520-527.

[4] YU G, HE P, SHAO L, et al. Enzyme activities in activated sludge flocs[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 77(3):605.

[5] 董玉瑛, 汪皓琦, 汪灵伟,等. 盐胁迫对污水处理厂好氧污泥不同酶活性的影响分析[J]. 大连民族大学学报, 2017, 19(1):11-13.

[6] 王静. 抗生素类污染物对活性污泥生物毒性测定方法的筛选与评价[D]. 上海：上海海洋大学, 2012.

[7] 王静, 黄申斌, 江敏,等. 抗生素类污染物对活性污泥酶活的影响研究[J]. 环境污染与防治, 2011, 33(12):27-32.

[8] LV Z H, YAO Y, LV Z M, et al. Effect of tetrahydrofuran on enzyme activities in activated sludge[J]. Ecotoxicology & Environmental Safety, 2008, 70(2):259-265.

[9] 许晓路, 申秀英. 活性污泥活性参数指标的选评[J]. 环境科学, 1993(2):58-62.

[10] 姜苏, 陈银广, 周琪. 活性污泥中水解酶的研究进展[J]. 环境科学与技术, 2006, 29(6):103-105.

[11] 王锐. 不同运行条件NMBR中微生物对6-APA废水适应性研究[D]. 哈尔滨：哈尔滨师范大学, 2014.

(责任编辑 赵环宇)

EffectsofPentachlorophenolonVariousEnzymeActivitiesinAerobicActivatedSludge

WANGLing-wei1,WANGHao-qi1,XINGYi-ming1,DONGYu-ying1,ZOUXue-jun1,ZHANGJin-gang2

(1.School of Environment and Resources, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China;2. Department of Life Science, Corning Incorporated, Boston 01801, USA)

X703

A

2017-06-07；

2017-06-23

国家自然科学基金项目(21477001)；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(DC201502070302)。

汪灵伟(1993-)，男，云南丽江人，大连民族大学环境与资源学院硕士研究生，主要从事新兴污染物风险评价研究。

董玉瑛(1968-)，女，辽宁锦州人，教授，博士，学校优秀学术带头人，主要从事环境化学与教学研究，E-mail:dongy@dlnu.edu.cn。

2096-1383(2017)05-0438-04