二溴海因复合消毒剂的研制与机理研究

易佳琳，李 健，胡培龙，李小林，陈 沁

（1. 上海大学生命科学学院，上海 200444；2. 上海出入境检验检疫局，上海 200135）

二溴海因复合消毒剂的研制与机理研究

易佳琳1，李 健2，胡培龙2，李小林2，陈 沁1

（1. 上海大学生命科学学院，上海 200444；2. 上海出入境检验检疫局，上海 200135）

目的研究二溴海因复合消毒剂（主要成分为二溴海因（DBDMH）和邻苯二甲醛（OPA））的消毒性能及杀菌机理，开发适合口岸使用的广谱高效消毒剂。方法用悬液定量杀菌实验，评估二溴海因复合消毒剂的杀菌效果；利用傅里叶红外光谱法和流式细胞法，研究消毒剂的杀菌机理。结果复合消毒剂对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的作用浓度（杀灭对数值大于5）分别为：100 mg/L DBDMH + 50 mg/L OPA、60 mg/L DBDMH + 210 mg/L OPA、200 mg/L DBDMH + 50 mg/L OPA。复合消毒剂能引起大肠杆菌外部形态变化，导致生物大分子上的羰基、亚氨基、磷酸二酯键和糖苷键不同程度断裂，使得ATP含量迅速下降，膜电位变化。结论复合消毒剂对细菌的杀灭效果较好。

二溴海因；大肠杆菌；消毒剂；ATP；金属腐蚀性

Abstract：[Objective]To investigate the disinfection performance and mechanism of Dibromohydantin combination disinfectant（Dibromo-5，5-dimethylhydantoin，DBDMH，Ortho-phthalaldehyde，OPA），and to develop a broad spectrum and high efficiency disinfectant suitable for port use. [Methods] Suspension quantitative sterilization test was used to examine the germicidal efficacy of the combination Dibromohydantin disinfectant，and the bactericidal mechanism of E. coli was investigated after treating by the disinfectant through Fourier Transform Infrared Spectrometer and Flow cytometer. [Results] The average killing logarithm was above 5 when E. coli，p. aeruginosa，S. aureu were exposed in 100 mg/L DBDMH+50 mg/L OPA，60 mg/L DBDMH+210 mg/L OPA，200 mg/L DBDMH+50 mg/L OPA separately. The external morphological of E.coli changed，which caused the carbonyl group，the imino group，the phosphate two ester bond and the glycosidic bond of the biological macromolecule were broken in different degrees. The content of ATP decreased rapidly and the membrane potential changed. [Conclusions] Dibromohydantin combination disinfectant has better effect on bacteria.

Key words：1，3-dibromo-5，5-dimethylhydantoin；Escherichia coli；disinfectant；ATP；metal corrosion

二溴海因是一种卤化衍生物，属于卤素类消毒剂，在溶解状态下释放活性Br-形成次溴酸。次溴酸可与含氮物质反应形成卤胺类物质干扰细菌代谢。次溴酸分解形成的新生态氧可以增加细胞膜的通透性[1-2]，从而对细菌、真菌、藻类起到广谱杀菌作用。二溴海因气味轻，刺激性小，是一种环境友好型消毒剂[3-4]，但在水中溶解度很小，只能以固体形式储存和使用[5]。邻苯二甲醛是一种重要的医药化工中间体，具有高效、低腐蚀、刺激性小及使用浓度低等优点，通过破坏细菌胞内蛋白和细胞核起到杀菌的作用[6-7]。二者协同使用，可以增强二溴海因对细菌细胞内官能团的作用能力。

鉴于此，本研究以二溴海因为主要成份，加入邻苯二甲醛形成复合消毒剂，选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为试验菌株，采用悬液定量杀菌和金属腐蚀性试验，制备二溴海因复合消毒剂，同时研究该复合消毒剂的杀菌机理，为其应用推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

二溴海因、邻苯二甲醛，由上海晶纯生化科技股份有限公司提供；大肠杆菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、铜绿假单胞菌（ATCC 15442），由上海出入境检验检疫局提供；金属片铜（GB2060）、铝（GB1173）、不锈钢（GB1220），购自金坛市振兴实验器材厂。

BacTiter-Glo微生物检测试剂盒，美国Promega公司生产；快速TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司生产；DiBAC4（3），西格玛奥德里奇贸易有限公司生产；傅里叶红外光谱仪 VERTEX70，德国Brckergongsi产品；LB、TSA培养基，购自国药集团化学试剂有限公司。其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1菌悬液制备。取待培养菌划线接种于TSA斜面，37 ℃培养18～24 h；用胰蛋白胨生理盐水溶液（TPS）水洗后，转移到无菌试管中，加入等体积的3%牛血清白蛋白（BSA），用电动混匀器混合20 s，制成菌悬液。

1.2.2悬液定量杀菌试验。用无菌硬水配制消毒剂；无菌试管内加入1.0 mL菌悬液和4.0 mL消毒液（对照组加等量无菌硬水），迅速混匀并立即计时；作用10 min后，分别吸取0.5 mL菌药混合液，加入装有4.5 mL中和剂的试管中混匀；10 min 后取1 mL样液，用无菌水稀释后接种至无菌培养皿；倒入TSA培养基并摇匀，待培养基凝固后置37 ℃培养箱培养48 h，平板菌落计数，计算杀灭对数值（KL）。

1.2.3温度、作用时间、pH等对复合消毒剂作用效果的影响。作用环境温度设为0、10、20、30、40 ℃，作用时间设为10、20、30、40、50、60、70 min。用NaOH或HCl将复合消毒剂溶液pH分别调节至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0；设置牛血清白蛋白（BSA）的浓度为25%、50%，分别进行悬液定量杀菌试验。

1.2.4金属腐蚀性试验。根据《消毒技术规范》进行[8]。取不锈钢、铜和铝金属片，经打磨、洗净、干燥后称量，按每片200 mL用量，浸泡72 h（以蒸馏水中浸泡作为对照），取出金属片，洗净，去腐蚀物，干燥后称重。每种金属取3次试验平均值，计算金属腐蚀率，判断腐蚀级别。

1.2.5电镜观察细菌形态。将复合消毒剂处理过的大肠杆菌及对照，在特制玻璃片上，用pH=6.8的戊二醛置于4 ℃冰箱中固定1.5 h；用pH=6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗3次，每次10 min；将材料放置于比例为100%的乙醇：叔丁醇=1:1的混合液和纯叔丁醇中，各浸泡1次，每次15 min；用冷冻干燥仪对样品进行干燥处理4 h；将样品观察面朝上，用导电胶带粘在扫描电镜样品台上，用离子溅射镀膜仪在样品表面镀一层金属银膜，电镜下观察菌落形态。

1.2.6傅里叶红外光谱。采用傅里叶红外光谱仪VERTEX70进行扫描[9]；仪器预热后，使用ZnSe液体池加样，扫描红外吸收光谱，扫描范围800～2 800 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数34，保存图谱分析生物大分子重要基团。

1.2.7细菌ATP含量。采用BacTiter-Glomicrobial viabilityassay检测细菌内ATP含量[10]；将复方消毒剂处理过的细菌菌液转移到96孔板中，每孔添加500 μL的LB培养基，并加入等体积的BacTiter-Glo试剂，孵化5 min；取混合液至不透光96孔板中，每个样品重复3次，用多功能酶标仪读取数值。

1.2.8细菌膜电位。将复合消毒剂处理过的细菌用DiBAC4（3）染料染色[11]；用MoFlo XDP流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，发射波长为（520±10）nm，将水90 ℃孵化3 min作为阳性对照；通过流式细胞仪的电子门，确定经热处理的菌液（阳性对照）与水样（阴性对照）的细菌染色数量；通过与阳性样品及阴性样品检测结果在图中特定位置的比较，确定经不同消毒剂处理后细菌膜电位的变化。

2 结果与分析

2.1 二溴海因复合消毒剂的研制

2.1.1消毒剂杀灭大肠杆菌浓度的筛选。取不同浓度二溴海因与邻苯二甲醛进行复配，测定不同配伍浓度下的杀灭大肠杆菌效果（表1）。结果发现，不同配伍浓度的消毒剂对大肠杆菌均有一定的杀灭作用，但存在差异。200 mg/L的OPA、300 mg/L的DBDMH对大肠杆菌的杀灭对数值均大于5，20 mg/L DBDMH与90 mg/L OPA、54 mg/L DBDMH与63 mg/L OPA、100 mg/L DBDMH与50mg/L OPA复配使用，对大肠杆菌的杀灭对数值也均大于5。可见2种消毒剂配伍后使用浓度均较低，说明消毒剂复配使用更有效。选取其中杀灭大肠杆菌对数值最高的配伍浓度，即100 mg/L DBDMH与50 mg/L OPA作为后续试验的使用浓度，用不同配比的二溴海因和邻苯二甲醛作用于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，结果发现复合消毒剂对金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌的杀灭效果也均优于单方消毒剂（表2）。

表1 不同配比消毒剂对大肠杆菌的杀灭效果

表2 不同配比消毒剂对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果

2.1.2温度、pH等因素对复合消毒剂杀灭大肠杆菌效果的影响。分别在不同温度、pH、时间和不同有机物浓度下，进行复合消毒剂悬液定量杀菌试验。结果显示：在0～40 ℃范围时，随着温度的升高，复合消毒剂对大肠杆菌的杀灭效果不断增强，40 ℃时的KL值约为0 ℃的1.5倍（图1-A）；消毒剂处理50 min内，随着杀菌时间的增加，杀菌效果逐渐上升，50 min后杀菌效果保持相对稳定（图1-B）。复合消毒剂在不同pH下对大肠杆菌的杀灭效果略有不同，在碱性条件下的杀菌效果优于酸性条件，当pH为9.0时，复合消毒剂杀灭大肠杆菌的效果最佳（图1-C）。参考2008版消毒规范[8]，用牛血清白蛋白（BSA）作为有机物进行试验，分别加入25%和50%的BSA后，消毒剂的杀菌效果受到影响，杀灭对数值只有3.06和2.28（图1-D）。

图1 温度、PH等因素对复合消毒剂杀灭大肠杆菌效果的影响

2.1.3复合消毒剂的金属腐蚀性。分别用200 mg/L DBDMH + 100 mg/L OPA（2倍大肠杆菌筛选浓度）和400 mg/L DBDMH + 200 mg/L OPA（4倍大肠杆菌筛选浓度）浸泡铜、不锈钢和铝，计算金属腐蚀速率。结果显示：200 mg/L DBDMH与100 mg/L OPA对铜和铝有轻度腐蚀，对不锈钢基本无腐蚀；加大处理浓度后，腐蚀性增加，尤其是铜片最为明显（表3）。故用复合消毒剂对铜制品消毒处理时，浓度不宜过高。

表3 复合消毒剂的金属腐蚀速率

2.2 二溴海因复合消毒剂杀菌机理研究

2.2.1复合消毒剂对细菌形态的影响。采用电镜扫描，观察二溴海因复合消毒剂处理过的大肠杆菌。结果显示：对照组中的大肠杆菌平均长度为1.7 μm，宽度为0.6 μm；复合消毒剂处理组中的大肠杆菌平均长度为1.2 μm，宽度为0.5 μm；同时，观察到复合消毒剂引起了大肠杆菌皱缩变形并在表面出现凹陷（图2）。

图2 大肠杆菌扫描电镜图

2.2.2复合消毒剂对细菌生物大分子重要基团的影响。用傅里叶红外扫描检测生物大分子中的化学键是否断裂。扫描发现，消毒剂处理过的菌液扫描曲线均在对照组之上（图3），说明消毒剂对细菌内各基团有破坏作用。在图3的基础上分别计算生物大分子羰基、亚氨基、磷酸二酯键和糖苷键的红外透射率差值，结果可见复合消毒剂处理过的大肠杆菌透射率差值均较单方消毒剂高（表4），说明复合消毒剂对大肠杆菌内各重要基团的损伤更为严重，推测这可能是其杀菌效果优于单方的原因之一。

图3 消毒剂对大肠杆菌红外吸收光谱的影响

表4 消毒剂处理大肠杆菌红外透射率差值（单位：%）

2.2.3复合消毒剂对细菌ATP含量的影响。消毒剂处理后，大肠杆菌的ATP含量降低，其中复合消毒剂处理后的ATP含量下降速度最快，5 min时的下降率是DBDMH的1.75倍，15 min后大肠杆菌中的ATP几乎无法测到，表明复合消毒剂对大肠杆菌中ATP含量的影响很大（图4）。

图4 消毒剂对大肠杆菌ATP含量的影响

2.2.4复合消毒剂对细菌膜电位的影响。用流式细胞仪检测经消毒剂处理过的DiBAC4（3）荧光染料染色后的大肠杆菌膜电位。结果显示：与对照组相比，热处理的细菌细胞膜电位丧失，细胞聚集于图中的三角区域内；消毒剂处理后的细胞也发生了不同程度的聚集，其中复合消毒剂处理后的细胞聚集程度最高，其次是DBDMH，OPA处理后细胞聚集比对照强一点（图5-A）。在图5-A基础上，计算聚集细胞占细胞总数的百分比，结果发现：复合消毒剂处理后细胞聚集的数量约为对照组的2.5倍，说明复合消毒剂对细胞膜电位的影响更为显著（图5-B）。

3 讨论

二溴海因具有稳定性好、含溴量高和反应活性高等优点，不仅能用于水产养殖业中各种疾病的预防和治疗，也可用于游泳池消毒、水果保鲜和工业用循环水灭藻，以及日常生活用品消毒等[12]，但因溶解性差限制了其使用。邻苯二甲醛是近年来研制的一种新型化学消毒剂，安全性相对较高，对人体刺激较小，杀菌能力强[13]，但价格较为昂贵。基于此，将2种消毒剂复合使用，结果显示约1/3剂量的DBDMH和1/4剂量的OPA复合使用可以达到高浓度的单方消毒剂对大肠杆菌同等的杀灭效果，50%剂量的DBDMH和OPA的复合消毒剂，对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果也高于单方，推测该复合消毒剂可能存在协同杀菌作用。

图5 消毒剂对大肠杆菌膜电位的影响（作用时间为10 min）

消毒剂的金属腐蚀性是应用时必须考虑的因素之一。本试验选取了2种高浓度的复合消毒剂分别对铜、不锈钢、铝进行了腐蚀性测试，结果均显示无强腐蚀性。这一结果相比当前市场上通常采用的2g/L二溴海因单方消毒剂的腐蚀性有所改进[14]。复合消毒剂腐蚀性较小的原因，主要是复配降低了腐蚀性较大的二溴海因的使用浓度。

杀菌机理是消毒剂性能研究的一个重要部分，对进一步提高消毒剂的杀菌效率具有指导意义[15]。二溴海因可以被分解为次溴酸；次溴酸同时释放出一定量的单质溴，形成一个动态的杀菌活性体系[16]。邻苯二甲醛主要作用于核糖体，同时还与甘氨酸、赖氨酸和组氨酸起交联反应，造成细菌多肽链或蛋白质变性，起到杀菌作用[17]。本研究采用傅里叶红外扫描的方法分析了复合消毒剂对细菌内结构和生物大分子的影响。通常，细菌内蛋白质上的羰基和亚氨基的红外吸收波长在1 500～1 800 cm-1之间，核酸内磷酸二酯键的红外吸收波长在1 085～1 090 cm-1之间[8，19]，细菌细胞膜上糖苷键的红外吸收波长在1 020～1 050 cm-1之间[21]。这些波长下红外透射率的变化可以反映细菌生物大分子上重要基团含量的变化。本研究中复合消毒剂对大肠杆菌中主要基团的影响均大于单方消毒剂，说明复合消毒剂对细菌的破坏作用更强。

ATP含量是细胞代谢活性的一个重要指标[20]。本试验中的ATP含量测定结果表明，复合消毒剂引起了细菌内ATP含量迅速下降，细菌生物活性降低。DiBAC4（3）是一种检测细胞膜电位的亲脂性阴离子荧光染料。它本身无荧光，当进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，若细胞内荧光强度增加，即膜电位增加，表示细胞去极化[21]。大肠杆菌经复合消毒剂处理后去极化的细胞占比明显增加，和热处理的细胞相似，荧光聚集在特定区域，说明消毒剂处理影响了细菌的膜电位，这一结果与电镜下观察到的细胞膜结构的破损一致。

4 结论

有效杀灭大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的二溴海因复合消毒剂的浓度分别为“100 mg/L DBDMH+50 mg/L OPA”“60 mg/L DBDMH+210 mg/L OPA”“200 mg/L DBDMH+50 mg/L OPA”。随着温度和杀菌时间的增加，复合消毒剂对大肠杆菌的杀灭效果增强，pH为9时复合消毒剂杀灭大肠杆菌的效果最好。有机物的存在会影响消毒剂的杀菌效果。复合消毒剂会引起大肠杆菌外部形态变化，使其生物大分子的羰基、亚氨基、磷酸二酯键和糖苷键发生不同程度断裂，同时导致其内部的ATP含量迅速下降，并伴随膜去极化。

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（责任编辑；朱迪国）

Development and Mechanism Study on Dibromohydantin Combination Disinfectant

Yi Jialin1，Li Jian2，Hu Peilong2，Li Xiaolin2，Chen Qin1
（1. School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444 ；2. Shanghai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135）

S851.36

B

1005-944X（2017）10-0104-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.027

国家科技支撑计划（2013BAD12B06）；国家重点研究发展项目（2016YFD0501101）

陈 沁