MicroRNA-25表达下调对神经胶质瘤U87细胞增殖与凋亡的影响

庞智寅，张云鹤，张涛，杨颖，付爱军，李建民，杨群福

（1.华北理工大学附属医院 神经外科，河北 唐山 063000；2.河北医科大学附属邢台市人民医院 神经外科，河北 邢台054000）

MicroRNA-25表达下调对神经胶质瘤U87细胞增殖与凋亡的影响

庞智寅1，张云鹤1，张涛2，杨颖2，付爱军1，李建民1，杨群福2

（1.华北理工大学附属医院 神经外科，河北 唐山 063000；2.河北医科大学附属邢台市人民医院 神经外科，河北 邢台054000）

目的探讨microRNA-25（miR-25）表达下调对神经胶质瘤U87细胞增殖与凋亡的影响，以及miR-25与B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）在胶质瘤细胞增殖与凋亡过程中的调节作用。方法通过慢病毒介导反义miR-25寡聚核苷酸转染U87细胞；分为3组，实验组（转染anti-miR-25）、对照组（转染negative control）和空白组（空白PBS）；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-25和Bcl-2的mRNA表达水平；CCK-8法检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果实验组miR-25和Bcl-2的mRNA表达量与空白组和对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），实验组降低；实验组相对于空白组和对照组，细胞增殖活性降低，细胞周期延缓，细胞凋亡率升高。结论在胶质瘤U87细胞，miR-25表达下调通过作用于Bcl-2靶基因，延缓细胞周期，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

神经胶质瘤；microRNA-25；B细胞淋巴瘤/白血病-2基因；增殖；凋亡

Abstract:ObjectiveTo study the effect of down-regulation of miR-25 expression on the proliferation and apoptosis of glioma U87 cells,and the regulatory effect of miR-25 and its target geneBcl-2on the proliferation and apoptosis process of glioma cells.MethodsU87 cells were transfected by lentiviral-mediated antisense miR-25 oligonucleotides.In the experiment groups(transfected with anti-miR-25),control groups(transfected with negative control)and blank groups(blank PBS),RT-PCR was used to detect the mRNA expression levels of miR-25 andBcl-2,CCK method was used to detect cell proliferation,flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis.ResultsThe mRNA expression levels of miR-25 andBcl-2in the experiment groups were lower than those in the the blank groups and the control groups,the differences were statistically significant(P＜0.05).Compared with the blank groups and the control groups,the cell proliferation activity was decreased,the cell cycle was delayed and the apoptosis rate was increased in the experiment groups.ConclusionsIn glioma U87 cells,down-regulation of miR-25 expression delays cell cycle,inhibits cell proliferation,and promotes apoptosis by targetingBcl-2gene.

Keywords:glioma；miR-25；Bcl-2；proliferation；apoptosis

神经胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，约占颅脑肿瘤的40%～50%以上。由于胶质瘤具有增殖快、易转移复发、恶性程度高等特点，手术治疗无法完全切除，并且由于血脑屏障的限制，抗肿瘤药物无法有效进入中枢神经系统，即使放化疗联合使用，效果仍不理想[1]。所以探索新的治疗方法迫在眉睫，基因治疗成为目前脑胶质瘤研究的热点[2]。微小RNA（microRNA，miR）是一类大小约为22nt的内源性、非编码小RNA，其可通过不同信号通路参与多种肿瘤的形成与发展，通过表达的上调或下调，起到癌基因或抑癌基因的作用。microRNA-25（miR-25）是microRNA家族中的重要成员之一，是一种癌基因，已有文献报道其在多种恶性肿瘤中呈高表达[3-7]。本研究旨在通过转染反义miR-25寡聚核苷酸，以揭示下调miR-25的表达对胶质瘤U87细胞增殖与凋亡的影响，及进一步探讨其对B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma/Leukemia-2，Bcl-2）的调控机制，从而寻找新的基因靶点，为脑胶质瘤的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人神经胶质瘤U87细胞系订购于中国医学科学院上海细胞库，FBS、DMEM培养基、Trizol试剂和PCR试剂盒均购自美国Invitrogen公司，Annexin-VFITC/PI试剂盒购自（杭州联科生物公司），CCK-8试剂盒购自北京天恩泽基因公司。从miRNAs目标靶基因数据库获得miR-25基因序列，委托上海吉玛基因公司设计合成慢病毒介导载体，并携带RFP基因标记的红色荧光，miR-25反向序列（anti-miR-21）：5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGC UA-3'及无义序列（negative control）：5'-UCUACUCUUUCUAGG AGGUUGUGA-3'。

1.2 方法

1.2.1 培养U87细胞 人神经胶质瘤U87细胞用含10%FBS、1%双抗的DMEM完全培养基，置于37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿度条件下培养，约1～2 d即可长满瓶底，当细胞生长汇合至80%时可进行消化传代。

1.2.2 细胞分组和转染 取生长良好的对数生长期细胞，常规消化制成单细胞悬液，以2×105～6×105个密度接种于6孔板中，实验分为：实验组（转染anti-miR-25），对照组（转染negative control）和空白组（空白PBS）。实验组和对照组参照吉玛慢病毒转染说明书操作，加入转染试剂和相应的慢病毒载体，空白组加入同等量的PBS，转染后常规培养，48 h后置于激光共聚焦显微镜下根据红色荧光率观察转染效率。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测mRNA表达 按本实验分组和转染操作，转染48 h后，取对数生长期细胞，常规消化制成单细胞悬液，Trizol说明书提取各组细胞总RNA，分光光度计定量检测RNA浓度及纯度，RNA浓度调整为500 ng/μl，M-MLV逆转录酶逆转录反应合成cDNA后，SYBR试剂盒行PCR扩增反应。引物序列：miR-25正向：5'-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3'，反向：5'-TGC TCATTGCACTTGTCTC-3'，扩增长度为326 bp；Bcl-2正向：5'-GCATGACTTCTCCCGCCTGTACCGT-3'，反向：5'-ACCTTAGCTGGCGCCGTACTGTTCT-3'，扩增长度为320 bp；GAPDH为内参基因，正向：5'-GATG CTGCGACTGGTCCA-3'，反向：5'-CTGCAGCAGCTA TGAACCTC-3'，扩增长度为368 bp，进行PCR扩增反应，PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，57℃退火25 s，72℃延伸30 s，总共40个循环后，再72℃终末延伸10 min，对实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）的结果采用相对定量Ct法分析。

1.2.4 CCK-8法检测各组细胞增殖 转染48 h后，各组均消化制成单细胞悬液，以每孔2×105个/ml的细胞密度接种于无菌24孔板中，并置于培养箱中培养，每隔24 h更换1次完全培养液；连续培养3 d，每隔1天每组各取12孔，每孔均更换500μl新的培养基，并加入50μl CCK-8溶液，将24孔板置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养2 h；在24孔板各孔中吸取100μl上清并依次加至96孔板各孔中；在波长490 nm处用酶标仪检测96孔板各孔光密度（OD）值。

1.2.5 流式细胞术分析细胞周期 转染48 h后，取对数生长期细胞，消化制成单细胞悬液，收集至1.5 ml EP管中，1 000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次加入预冷70%乙醇1 ml悬浮细胞，4℃固定细胞20 h以上，离心去除乙醇，PBS洗涤2次，离心去除上清液，加入500μl PI染色液，4℃下避光40 min以上。离心PBS重悬细胞，400目滤网过滤细胞悬液，经FACS流式细胞仪系统检测，Modifit软件计算DNA指数和各期细胞的百分数。

1.2.6 流式细胞术分析细胞凋亡 转染48 h后，各组细胞消化成单细胞悬液，收集至1.5 ml EP管中，4℃，1 000 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS重悬细胞并计数，调节细胞悬液浓度为1×105个/ml，取195μl细胞悬液。加入500μl Buffer悬浮细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入5μl AnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10μl PI，避光预冷4℃孵育10 min后，1 h内行流式细胞仪检测，Modifit软件分析结果。

1.3 统计学方法

运用SPSS17.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析和重复测量设计的方差分析，组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞转染率

根据慢病毒载体携带RFP标记的红色荧光，发射光波长520 nm，激发光波长48 nm，利用奥林巴斯FV-1000软件进行图像观察，判断转染效率，激光共聚焦显微镜可见荧光率可达90%以上（见图1），说明转染率高。

图1 慢病毒介导转染效率 （激光共聚焦显微镜×400）

2.2 各组细胞miR-25和Bcl-2的mRNA表达水平

各组miR-25和Bcl-2的mRNA相对表达量见表1，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），各组miR-25和Bcl-2的表达量有差别；空白组miR-25和Bcl-2的mRNA表达量较高，进一步两两比较显示，与空白组相比，对照组miR-25和Bcl-2的mRNA表达量数值间差异无统计学意义（t=25.320和20.314，P=0.065和0.083），与空白组相比，实验组miR-25和Bcl-2的mRNA表达量均降低（t=26.328和30.502，均P=0.000）。

表1 各组miR-25和Bcl-2 mRNA的表达量比较（n=6，±s）

表1 各组miR-25和Bcl-2 mRNA的表达量比较（n=6，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与空白组比较，P＜0.05

2.3 各组细胞增殖活性

各组细胞在24、48、72 h的OD值见表2。采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点间细胞增殖能力有差别（F=43.035，P=0.000），随培养时间延长，其OD值逐渐增大，细胞增殖能力逐渐增强。②各组间细胞增殖能力有差别（F=30.330，P= 0.000），实验组相较于对照组和空白组细胞增殖能力逐渐降低；对照组和空白组之间细胞增殖能力差别不大。③实验组与对照组和空白组细胞增殖能力变化趋势有差别（F=17.024，P=0.001）。

表2 不同时间点各组细胞OD值比较（n=6，±s）

表2 不同时间点各组细胞OD值比较（n=6，±s）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与空白组比较，P＜0.05

组别48 h 0.14±0.521）2）0.36±0.231）2）0.13±0.45 0.40±0.35空白组72 h实验组 0.52±0.121）2）对照组 0.82±0.5324 h0.15±0.06 0.46±0.25F值 1.426 2.568 1.118P值 0.022 0.013 0.002 0.90±0.60

2.4 各组细胞周期分布情况

各组细胞周期的分布情况见图2。空白组、对照组和实验组的各组细胞分布：G0/G1期分别为（54.38±1.96）、（53.06±2.55）和（70.12±1.83）；S期分别为（33.82±4.15）、（36.06±1.45）和（23.62±1.10）；G2/M期分别为（11.82±2.65）、（10.96±1.95）和（6.35±0.83）。实验组细胞周期主要分布于G0/G1期，少部分处于S期和G2/M期。实验组G0/G1期的细胞比例与对照组和空白组比较，差异有统计学意义（F=29.550，P=0.015），实验组高；S期和G2/M期的细胞比例与对照组及空白组比较，差异有统计学意义（F=23.290，P=0.001；F=26.459，P=0.000），实验组低；空白组和对照组之间比较，差异无统计学意义（F=32.116，P=0.085）。说明下调miR-25的表达可降低U87细胞S期、G2/M期细胞的比例，延缓细胞周期的进展，抑制U87细胞增殖。

2.5 各组细胞凋亡情况

流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示，空白组、对照组和实验组的细胞凋亡率分别为（2.78±0.32）%、（3.12±0.25）%和（10.56±0.06）%（见图3）。实验组细胞凋亡率大于空白组和对照组。实验组细胞的凋亡率与空白组和对照组比较，差异有统计学意义（F=11.065，P=0.005）；而空白组和对照组之间差异无统计学意义（F=15.131，P=0.064）。说明通过慢病毒介导miRNA-25表达的下调，可提高脑胶质瘤U87细胞的凋亡率，促进细胞凋亡。

图2 各组细胞周期分布情况

图3 各组细胞凋亡情况

3 讨论

神经胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，起源于神经间质细胞和神经实质细胞。发病年龄为30～40岁之间，恶性程度高，具有高度侵袭和浸润性，手术难以切除干净，由于血脑屏障的限制，放化疗对胶质瘤治疗效果不佳，使得神经胶质瘤成为最难治愈的肿瘤之一[8]。虽然近年来手术和放疗等技术有很大的进步，但脑胶质瘤病人的平均生存时间只有1.0～ 1.5年，患者几乎均死于肿瘤复发、局部扩散和转移[9]。总体上说，神经胶质瘤具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低的“三高一低”特点[10]。研究认为脑胶质瘤形成主要是通过不同机制对多基因表达及其信号通路的异常调控来完成。因此，胶质瘤的基因治疗成为目前研究的热点。本研究试图寻找针对神经胶质瘤形成和发展的作用调控靶点，为神经胶质瘤的靶向治疗提供新思路。

miR是一类长度为21～25 nt的非编码RNA，通过降解靶mRNA或翻译抑制起到基因表达调控作用。研究表明miR在细胞的分化、增殖、迁移、凋亡等生物学行为过程中发挥重要作用，并参与多种肿瘤的发生、发展、侵袭和转移。近年来miR在脑胶质瘤中的作用机制也逐渐被人们所了解。有研究利用基因芯片分析脑胶质瘤组织及其细胞系的相关miR表达，发现在胶质瘤细胞中miR表达上调的癌基因有23种（如miR-21、miR-221/222、miR-25），另有 34种 miR表达下调的抑癌基因 （如miR-125b、miR-251）[11]。miR-25属于miR-106b-25家族，目前，有研究报道miR-25在恶性肿瘤中表达普遍上调，与肿瘤的发生、发展、增殖和转移密切相关[12]。有研究运用实时定量PCR方法检测不同脑胶质母细胞瘤细胞系及不同病理级别胶质瘤中miR-25基因的表达水平，结果发现miR-25在胶质瘤中表达呈不同程度增高，并与胶质瘤的WHO病理分级呈正相关[13]。有研究发现miR-25在肝癌中异常高表达，而下调miR-25可以抑制肝癌细胞的周期进展，G1期细胞比例增加[14]，上调miR-25的表达则可以促进BE食管细胞和肺成纤维细胞的增殖速率[15]。本实验通过慢病毒介导反义miR-25寡聚核苷酸转染脑胶质瘤U87细胞。结果发现，转染反义miR-25寡聚核苷酸的实验组miR-25 mRNA表达量相较于空白组和对照组下调，实验组细胞增殖活性降低，细胞周期延缓，细胞凋亡率增加。说明下调miR-25的表达可抑制神经胶质瘤U87细胞增殖，延缓细胞周期，促进细胞凋亡。

Bcl-2是抗调亡蛋白，属于调节调亡的蛋白质家族。它在细胞凋亡进程中发挥关键作用。Bcl-2的过表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。UCHIDA等[16]研究发现使用Bcl-2反义核甘酸序列抑制Bcl-2表达后可以抑制肾癌细胞的增殖并诱导调亡，提示Bcl-2的反义序列可以用于肾癌的治疗。目前研究发现多种miR可通过调节Bcl-2的表达而起到抑制肿瘤细胞增殖并诱导调亡的作用。CHEN[17]等通过瞬时转染技术研究发现miR-181a可通过对Bcl-2的靶向调节作用而增加U87MG恶性胶质瘤对放疗的敏感性。NAN等[18]发现用miR-451寡核苷酸模拟物转染U251、A172和LN229等胶质瘤细胞后，Bcl-2表达均下调。本实验通过转染反义miR-25寡聚核苷酸转染入脑胶质瘤U87细胞。结果发现，转染反义miR-25寡聚核苷酸的实验组Bcl-2 mRNA表达量相较于空白组和对照组下调，并且实验组细胞增殖活性降低，细胞周期延缓，细胞凋亡率增加。说明Bcl-2是miR-25的作用靶点，下调miR-25表达可作用于Bcl-2靶基因抑制U87细胞增殖，延缓细胞周期，促进细胞凋亡。

综上所述，通过下调miR-25的表达，可抑制神经胶质瘤U87细胞增殖和促进细胞凋亡，miR-25对神经胶质瘤细胞有着重要的调控作用，miR-25有望成为神经胶质瘤诊断和治疗的新目标靶点。但目前miR与神经胶质瘤的相关研究仍处于初级阶段，目前miR在细胞分子水平对神经系统的致瘤作用有一定的研究，但其在动物实验研究较少，临床实验研究更是空白，此外，由于神经系统存在血脑屏障，如何保证药物的有效运输、靶向定位及安全效应都需要进一步科学研究。不过随着首个miR靶向治疗药物（LNA-AntimiRTM-122）进入2期临床试验，miR在人类疾病的治疗中迈出了重要的一步，随着不断深入的研究，其在神经系统肿瘤的诊断方法、治疗手段和检测预后等也必将发挥更为重要的作用，表现出更加广阔的应用前景。

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（张蕾 编辑）

Effect of down-regulation of miR-25 expression on proliferation and apoptosis of glioma U87 cells

Zhi-yin Pang1,Yun-he Zhang1,Tao Zhang2,Ying Yang2, Ai-jun Fu1,Jian-min Li1,Qun-fu Yang2
(1.Department of Neurosurgery,the Affiliated Hospital,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China；2.Department of Neurosurgery,the Affiliated Xingtai People's Hospital,Hebei Medical University,Xingtai,Hebei 054000,China)

R739

A

2016-11-09

张云鹤，E-mail：578423966@qq.com

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.007

1005-8982（2017）22-0036-06