UGT1A1和CYP2E1基因多态性与一线抗结核药物所致肝损伤易感性研究

孙勤 刘轾彬 沙巍 肖和平

·论著·

UGT1A1和CYP2E1基因多态性与一线抗结核药物所致肝损伤易感性研究

孙勤 刘轾彬 沙巍 肖和平

目的探讨Ⅰ相药物代谢酶的细胞色素P450 2E1(CYP2E1)和Ⅱ相药物代谢酶的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)基因多态性与抗结核药物所致肝损伤(ATDILI)易感性的相关性。方法收集2012年3月至2015年12月期间在上海市肺科医院住院的经一线抗结核药物治疗后发生肝损伤的患者461例(为ATDILI组)，与同期住院未发生肝损伤的患者466例(为非ATDILI组)；对两组患者的临床信息进行统计分析，同时采集两组患者的外周静脉血进行基因组DNA提取和基因分析；采用生物信息统计学方法筛选出与CYP2E1和UGT1A1基因14个标签单核苷酸多态性位点(tagSNP；Hardy-Weinberg平衡P值>0.001，最小等位基因频率>0.1，r2>0.8)，应用SNPscanTM多重SNP分型技术对研究对象DNA样本进行基因分型，分析这些位点基因型和单倍型在ATDILI组和非ATDILI组之间的频率及分布差异，分析在显性、隐性和加性遗传模型下各个SNP位点与ATDILI易感性的关联性。结果所有位点的等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡。ATDILI组UGT1A1基因rs4148323位点AA基因型频率(1.7%，8/461)明显低于非ATDILI组(4.3%，20/466)，显示携带rs4148323位点AA基因型可降低ATDILI患病的风险(OR=0.37，95%CI=0.16～0.86，P=0.020)；在隐形遗传模型下，携带该位点AA基因型可明显降低ATDILI患病的风险(OR=0.39，95%CI=0.17～0.90，P=0.023)；在加性遗传模型下，携带该位点突变型A等位基因可明显降低ATDILI患病风险(OR=0.79，95%CI=0.63～0.99，P=0.040)。单倍型分析显示：ATDILI组UGT1A1基因ATG单倍型频率(0.19)明显低于非ATDILI组(0.22)，说明携带ATG单倍型可明显降低ATDILI患病的风险(OR=0.79，95%CI=0.63～0.99，P=0.045)。未发现其他位点与ATDILI的相关性。结论UGT1A1基因为中国汉族人群ATDILI的易感基因。

结核； 药物性肝损伤； 多态性，单核苷酸； 疾病遗传易感性

化疗对结核病的防治尤为重要，但抗结核药物在治疗疾病的同时会造成部分患者发生不良反应，如抗结核药物所致肝损伤(anti-TB drug induced liver injury，ATDILI)。笔者前期队列研究发现，ATDILI在使用一线抗结核药物的住院患者中发生率约为12.9%，可导致患者痰菌阴转率和肺内空洞闭合率下降，治疗失败率明显提高[1]。造成ATDILI的原因是多方面的，随着分子生物学的发展，越来越多证据表明：遗传因素是造成药物不良反应个体间或群体间差异明显的决定性因素。参与抗结核药物在体内代谢的药物转运体、药物代谢酶等的遗传多态性可引起相关底物功能发生改变，从而影响药物在体内的吸收、分布等代谢过程和中间代谢产物[2-5]。同其他药物一样，抗结核药物在体内的代谢主要经历2个时相：Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢。本研究选择Ⅰ相药物代谢酶的细胞色素P450 2E1(cytochrome P 450 2E1，CYP2E1)和Ⅱ相药物代谢酶的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UDP-glucuronosyltransferase1 A1，UGT1A1)基因作为候选基因，采用生物信息统计学筛选出目标基因的全部标签单核苷酸多态性位点(tagSNP)，通过大样本的病例-对照研究UGT1A1和CYP2E1基因是否是中国汉族人群ATDILI的易感基因。

资料和方法

1.研究对象：收集2012年3月至2015年12月期间在上海市肺科医院住院的经一线抗结核药物治疗后发生肝损伤的患者461例(为ATDILI组)，与同期住院未发生肝损伤的患者466例(为非ATDILI组)。ATDILI组中，男283例，女178例；平均年龄(38.2±13.7)岁，体质量指数(BMI)为22.3±3.8；非ATDILI组中，男287例，女179例；平均年龄(38.9±13.5)岁，BMI为23.1±3.4。两组比较：性别构成比、年龄和BMI均数的差异均无统计学意义(χ2=0.004，P=0.950；t=0.219，P=0.225；t=0.247，P=0.176)。本研究通过同济大学医学院和上海市肺科医院的伦理审查，所有患者均经过知情同意。

2.纳入排除标准：(1)纳入标准：①均为上海市接受全程督导短程化学治疗(DOTS)的结核病患者，年龄范围16～65岁；②采用标准化初治化疗方案，强化期为2～3个月的异烟肼(0.3 g/d)、利福平(0.45～0.6 g/d)、乙胺丁醇(0.75 g/d)和吡嗪酰胺(1.5 g/d)；③HIV感染阴性。(2)排除标准：①患有基础性肝病(如各种病毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病、酒精性肝病等)及抗结核治疗前存在肝功能不全者；②一开始未采用标准化治疗者(如乙型肝炎病毒DNA阳性的活动性肝炎，重症结核性脑膜炎采用大剂量和4种以上抗结核药物等)；③治疗中途因非肝损伤原因更改化疗方案者[如初次药物敏感性试验(简称“药敏试验”)提示耐药、菌种鉴定为非结核分枝杆菌，以及因发生其他不良反应变更方案等]。

3.诊断标准：ATDILI诊断参照《抗结核药所致药物性肝损伤诊断与处理专家建议》[6]，概括如下：血清丙氨酸转氨酶(ALT)>2倍正常值上限(ULN)或总胆红素(TBIL)>2倍ULN；或天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和TBIL同时升高，且至少1项>2倍ULN。

4.UGT1A1和CYP2E1基因tagSNP的筛选：采用HapMap数据库载入UGT1A1和CYP2E1基因，每个基因上下游各扩展10 kb区域，将获得的位点导入Haploview(version 4.1)，以下述标准进行位点质控：Hardy-Weinberg平衡(HWE)P值>0.001，最小等位基因频率>0.1，r2>0.8。最后共获得14个tagSNP，位点信息见表1。

5.基因组DNA提取和基因分型：采集受试者外周静脉血2 ml保存至乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，采用Qiagen DNeasy全血DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)并按照标准操作说明进行基因组DNA提取。由上海天昊生物科技有限公司采用SNPscanTM多重SNP分型技术对所有DNA进行基因分型，连接反应、连接产物多重荧光PCR扩增、扩增产物荧光毛细管电泳分离均参考试剂盒说明书。PCR扩增产物用美国ABI公司 ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳，测序仪上收集的原始数据用 GeneMapper 4.1(美国Applied Biosystems公司)分析。

结 果

1.UGT1A1和CYP2E1基因多态性与ATDILI易感性的相关性：UGT1A1和CYP2E1基因共14个tagSNP在461例ATDILI和466例非ATDILI患者中进行了基因分型，所有位点的等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(表1)。结果显示：携带UGT1A1基因rs4148323位点AA基因型可明显降低ATDILI患病的风险(OR=0.37，95%CI=0.16～0.86，P=0.020)，见表2。同时，在隐形遗传模型下，携带UGT1A1基因rs4148323位点AA基因型可明显降低ATDILI患病的风险(OR=0.39，95%CI=0.17～0.90，P=0.023)；在加性遗传模型下，携带UGT1A1基因rs4148323位点突变型A等位基因可明显降低ATDILI患病风险(OR=0.79，95%CI=0.63～0.99，P=0.040)，未发现UGT1A1基因余下tagSNP与ATDILI患病易感性相关，本研究也未发现CYP2E1基因与ATDILI患病有相关性(表3)。

表1 CYP2E1和UGT1A1基因共14个tagSNP信息

注HWE：Hardy-Weinberg平衡检验；MAF：最小等位基因频率

2.UGT1A1和CYP2E1基因单倍型与ATDILI易感性的相关性：采用Haploview 4.1软件绘制UGT1A1基因4个位点和CYP2E1基因10个位点的LD分布图，UGT1A1基因含有1个LD区，包括rs4148323、rs4148326、rs12479045等位点。CYP2E1基因分为2个LD区，LD区1由2个位点组成：rs10857736、rs3813867；LD区2由6个位点组成：rs915908、rs4646976、rs743535、rs2249695、rs1952467、rs4240522。根据LD分布图确定相应的单倍型并分析单倍型频率在两组间的分布。结果显示：携带UGT1A1基因ATG单倍型可明显降低ATDILI患病风险(OR=0.79，95%CI=0.63～0.99，P=0.045)。未发现携带UGT1A1基因余下的单倍型与CYP2E1基因任一单倍型与ATDILI患病相关(表4)。

表2 CYP2E1和UGT1A1基因14个tagSNP在ATDILI组和非ATDILI组的基因型频率分布比较

续表2

表3 CYP2E1和UGT1A1基因14个tagSNP在不同遗传模型下与ATDILI易感性的相关性

续表3

表4 CYP2E1和UGT1A1基因单倍型频率与ATDILI易感性的相关性

讨 论

现有关于ATDILI易感基因的研究结论缺乏一致性，甚至在同一地区同一人种都得不到一致性的结果，原因在于研究设计存在一定的局限性：(1)所纳入的样本数尤其是病例组样本例数非常少，往往只有数十例，而足够大的样本数量是基因SNP和表型相关研究的最关键因素之一，理论上讲样本量越大结论越可靠；(2)先前研究包含的SNP位点较少，往往是选择单个或少数几个SNP位点，无法覆盖目标基因的大部分区域。本研究通过生物信息统计学方法筛选出UGT1A1和CYP2E1基因包括上下游各扩展10 kb区域内的全部tagSNP，采用较大样本病例对照研究在927例中国汉族人群中进行基因分型，发现UGT1A1基因多态性与ATDILI易感性密切相关，但未发现CYP2E1基因与ATDILI相关。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)是生物体内最为重要的Ⅱ相药物代谢酶，它主要催化内源性物质(如胆红素、类固醇类)或外源化合物(如各种药物、酚类)与辅因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸结合，增加亲脂性底物的极性，促进其从尿液或胆汁排出。因此，葡萄糖醛酸化反应可以降低化合物的活性或者毒性，同时加速化合物的清除，在肝脏代谢解毒方面发挥着重要的作用[7-9]。UGT1A1是UGT基因超家族中的一员，位于染色体2q，UGT1A1酶主要分布于肝脏。关于UGT1A1基因多态性与ATDILI相关性的研究目前非常少见。有研究显示：UGT1A1*27和UGT1A1*28与ATDILI易感性相关并可增加患者抗结核药物治疗后发生肝损伤的风险 (OR=13.859，95%CI=1.085～177.056，P<0.05)[8]，该研究中只有17例ATDILI患者，结果很可能存在偏倚。Chen等[9]则未发现UGT1A1基因与ATDILI易感性存在相关，该研究中病例组也只包含87例。本研究发现：携带UGT1A1基因rs4148323位点AA基因型明显降低ATDILI患病的风险，携带其突变A等位基因在加性模型下明显降低ATDILI患病风险。同时，单倍型分析显示携带UGT1A1基因ATG单倍型可降低ATDILI患病风险。考虑携带突变A等位基因或ATG单倍型可能增加UGT1A1基因的表达从而增强UGT1A1酶的活性，通过葡萄糖醛酸化反应加速抗结核药物毒性产物的清除，起到护肝脏的作用。

CYP450酶系是最为重要的Ⅰ相代谢酶，临床上约60%～70%的药物通过其代谢。CYP2E1是CYP450家族中的一员，肝脏是CYP2E1分布含量最高的器官，其基因CYP2E1位于染色体10q。关于CYP2E1基因多态性是否与ATDILI易感性相关，目前国内外研究结果还存在很大争议。Singla等[5]报道，CYP2E1*5B的c1/c2杂合子基因型与ATDH易感性相关(OR=7.47，95%CI=1.263～34.32，P=0.04，n=17)；王涛等[10]研究结果指出，CYP2E1基因Rsa Ⅰ cl/c1野生基因型与ATDILI的发生相关(OR=1.979，95%CI=1.106～3.891，P=0.023，n=85)；也有研究未发现CYP2E1与ATDILI易感性相关[11-12]。本研究虽然验证了CYP2E1基因及其上下游各10 kb区域的10个tagSNP在较大样本(461例ATDILI组与466例非ATDILI组)中基因型频率、单倍型频率及分布的差异，但未发现任一位点与ATDILI易感性相关。

综上所述，本研究发现UGT1A1基因为中国汉族人群ATDILI的易感基因，无论是基因型还是单倍型分析。这些发现进一步补充了ATDILI的分子遗传机制，为临床上通过检测易感基因来预测ATDILI 患病提供了有力依据。下一步应研究UGT1A1基因rs4148323位点是否调控及如何调控基因的表达和蛋白质的功能、降低ATDILI患病的具体分子机制。

[1] 孙勤, 孙雯雯, 沙巍, 等. 抗结核药物所致肝损伤的危险因素及其对结核病患者治疗结局影响的回顾性队列研究. 中华传染病杂志, 2015, 33(12): 725-730.

[2] 邓国防, 孙丽珍, 詹森林, 等. 有机阴离子转运多肽1B1基因多态性和利福平血药浓度对肝毒性的影响. 中国防痨杂志, 2015, 37(9): 933-937.

[3] 张俊仙, 吴雪琼. 抗结核药物所致肝损伤的分子机制. 中国防痨杂志, 2014, 36(1): 3-8.

[4] 陈茹, 王晶, 唐少文, 等. 抗结核治疗队列人群药物性肝损害的易感基因多态性研究. 中华流行病学杂志, 2016, 37(7): 925-929.

[5] Singla N, Gupta D, Birbian N, et al. Association of NAT2, GST and CYP2E1 polymorphisms and anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity. Tuberculosis (Edinb), 2014, 94(3): 293-298.

[6] 中华医学会结核病学分会, 《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会. 抗结核药所致药物性肝损伤诊断与处理专家建议. 中华结核和呼吸杂志, 2013, 36(10): 732-736.

[7] 郝金奇, 陈怡, 李世明, 等. 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A7基因多态性与抗结核药致肝损伤易感性的关系. 中华传染病杂志, 2012, 30(3): 174-178.

[8] Chang JC,Liu EH,Lee CN,et al. UGT1A1 polymorphisms associated with risk of induced liver disorders by anti-tuberculosis medication. Int J Tuberc Lung Dis,2012, 16(3): 376-378.

[9] Chen R, Wang J, Tang SW, et al. CYP7A1, BAAT and UGT1A1 polymorphisms and susceptibility to anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity. Int J Tuberc Lung Dis, 2016, 20(6): 812-818.

[10] 王涛, 王巍, 王仲元, 等. 细胞色素P450-2E1基因多态性与抗结核药物性肝损害的相关性. 中华结核和呼吸杂志, 2009, 32(8): 585-587.

[11] Sharma SK,Jha BK,Sharma A,et al. Genetic polymorphisms of CYP2E1 and GSTM1 loci and susceptibility to anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity. Int J Tuberc Lung Dis, 2014, 18(5): 588-593.

[12] Tang S, Lv X, Zhang Y, et al. Cytochrome P450 2E1 gene polymorphisms/haplotypes and anti-tuberculosis drug-induced hepatitis in a Chinese cohort. PLoS One, 2013, 8(2): e57526.

(本文编辑：李敬文)

AssociationbetweenUGT1A1andCYP2E1genepolymorphismsandsusceptibilityoffirst-lineanti-tuberculousdruginducedliverinjury

SUNQin,LIUZhi-bin,SHAWei,XIAOHe-ping.

ClinicandResearchCenterofTuberculosis,ShanghaiKeyLaboratoryofTuberculosis,ShanghaiPulmonaryHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200433,China

Correspondingauthor：SHAWei,Email:shfksw@126.com

ObjectiveTo explore the association between a phase Ⅰ drug metabolizing enzyme encoding geneCytochromeP450 2E1 (CYP2E1) and a phase Ⅱ drug metabolizing enzyme encoding geneUDP-glucuronosyltransferase1 (UGT1A1) and susceptibility of first-line anti-tuberculous drug induced liver injury (ATDILI).MethodsFour hundred and sixty-one patients with ATDILI and 466 patients with non-ATDILI who were hospitalized in Shanghai Pulmonary Hospital from March 2012 to December 2015 were included in this study. The clinical characteristics of the two groups were compared. A whole blood sample was collected from each patient for genomic DNA extraction and genotype analysis. Fourteen tagSNPs ofUGT1A1 andCYP2E1 gene were selected using systematic bioinformatic analysis (Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE)-P>0.001, Minimum-allele Frequency >0.1,r2>0.8). We performed a population based case-control study to genotype the 14 tagSNPs ofUGT1A1 andCYP2E1 gene using SNPscanTMtechnology. The genotype and haplotype frequencies were detected and compared between the two groups. Three genetic models including dominant, recessive and additive model were used to analyze the association between all the selected SNPs polymorphisms and susceptibility of ATDILI.ResultsAll the alleles frequencies of these SNPs were in HWE. We found that in ATDILI group, the frequency ofUGT1A1 rs4148323 AA genotype (1.7%, 8/461) was significantly lower than that in non-ATDILI group (4.3%, 20/466), which indicated that thers4148323 A/A carriers had a decreased risk for developing ATDILI (OR=0.37, 95%CI=0.16-0.86,P=0.020). In recessive model, rs4148323 A/A was also associated with a decreased risk for ATDILI (OR=0.39, 95%CI=0.17-0.90,P=0.023). In additive model, allele of rs4148323 minor A was found to be associated with risk reduction with ATDILI (OR=0.79, 95%CI=0.63-0.99,P=0.040). Haplotype analysis showed the frequency of ATG haplotype ofUGT1A1 gene in ATDILI group (0.19) were significantly lower than that in non-ATDILI group (0.22), which demonstrated that ATG haplotype was related to the decreasing of ATDILI incidence (OR=0.79, 95%CI=0.63-0.99,P=0.045). We didn’t find any other SNP that was associated with ATDILI.ConclusionOur study showed thatUGT1A1 gene is a susceptibility gene of ATDILI in Chinese Han population.

Tuberculosis; Drug-induced liver injury; Polymorphism, single nucleotide; Genetic predisposition to disease

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.10.010

国家自然科学基金青年项目(81400006)；上海市浦江人才计划(16PJD041)；国家科技重大专项(2014ZX09507008)

200433 同济大学附属上海市肺科医院结核病临床研究中心 上海市结核(肺)重点实验室

沙巍，Email：shfksw@126.com

2017-03-02)