Wnt/β-catenin信号通路抑制剂对脑胶质瘤细胞迁移的影响

赵贤军 康 暐 袁国强 周旺宁 潘亚文

(兰州大学第二医院神经外科，甘肃 兰州 730030)

Wnt/β-catenin信号通路抑制剂对脑胶质瘤细胞迁移的影响

赵贤军 康 暐 袁国强 周旺宁 潘亚文

(兰州大学第二医院神经外科，甘肃 兰州 730030)

目的探讨Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路抑制剂对脑胶质瘤细胞迁移能力的影响。方法抑制组用浓度为20 μmol/L的Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535处理脑胶质瘤U251细胞，对照组细胞中不加入抑制剂。培养48 h后，噻唑蓝(MTT)检测各组细胞的存活率，细胞划痕实验检测各组细胞的迁徙率，Transwell小室检测各组细胞迁移的数目，用Western印迹法检测细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、C-myc、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2蛋白的表达水平。结果抑制组细胞存活率、细胞迁移数目、迁徙率和MMP-9、MMP-2蛋白水平与对照组相比明显降低(P<0.01)。抑制组细胞中β-catenin、C-myc水平明显低于对照组(P<0.01)。结论Wnt/β-catenin信号通路抑制剂能够抑制脑胶质瘤细胞增殖、迁徙及迁移能力。

脑胶质瘤；增殖；迁移；Wnt/β-catenin信号通路

脑胶质瘤是一种颅内肿瘤，发病率在全部恶性肿瘤发病率中占2%左右，治疗后的生存期只有8～11个月〔1〕。Wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌、肺癌、肝癌、血管瘤、脑胶质瘤、前列腺癌等多种癌症发生过程中发挥调控作用〔2〕。有研究表明，20 μmol/L的Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路抑制剂FH535能够抑制舌鳞癌、鼻咽癌细胞的生长，对癌细胞的迁移能力也具有一定的抑制作用〔3〕。本研究探究Wnt/β-catenin信号通路抑制剂作用后的脑胶质瘤细胞生长、迁徙和迁移能力的影响，以期为靶向抑制Wnt/β-catenin信号通路治疗脑胶质瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1细胞 人胶质瘤细胞株U251购自中国科学院细胞库。

1.2主要仪器及试剂 RPMI1640培养基购自美国Gibco；胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone；β-catenin单克隆抗体、C-myc单克隆抗体、基质金属蛋白酶(MMP)-9单克隆抗体、MMP-2单克隆抗体、β-actin单克隆抗体均购自美国CTS；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自美国Pierce；CO2培养箱购自美国Thermo；倒置显微镜购自日本Nikon。

1.3细胞培养 将保存于液氮中的胶质瘤细胞U251取出后放置37℃水浴锅中溶解，8 000 r/min离心10 min，弃上清液，加5 ml细胞培养液悬浮细胞，接种于细胞培养瓶，放在37℃、5%CO2培养箱中培养。观察细胞密度达到90%时，弃去细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞两次，用0.25%的胰蛋白酶对细胞进行消化，根据实验要求接种到细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.4噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 U251细胞培养至对数期后消化，用细胞培养液把浓度调整到2×104个/ml，每孔加入100 μl细胞悬浮液接种到96孔细胞培养板中，培养过夜，弃细胞培养液，在细胞中加入含有Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535浓度为20 μm的培养液，放置37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，在细胞中加入体积为10 μl，5 mg/ml的MTT，37℃下结合4 h。将上清液吸除后，加100 μl的二甲基亚砜(DMSO)。为了提高实验的准确性，每组设置6个复孔，以不加入细胞的孔为空白组用于调零。观察结晶物完全融化后，放置于酶标仪上检测每孔的光密度值(OD值)，计算每组细胞存活率。细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.5细胞划痕实验检测细胞迁徙能力 U251细胞培养至对数期后种植到24孔板中继续培养8h。在贴壁细胞中用枪头小心的划出一条细痕，用PBS把划下的细胞洗掉。加入含有Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535浓度为20 μmol/L的培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后观察细痕的宽度。用细胞迁徙率表示细胞迁徙能力。迁徙率=(迁徙距离÷0 h划痕距离)×100%。

1.6Transwell小室检测细胞迁移能力 U251细胞培养至对数期后用胰蛋白酶消化并收集细胞。用含有Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535浓度为20 μmol/L的培养液悬浮细胞，调整细胞浓度为5×106个/ml，在Transwell小室的下室加入600 μl含有10% FBS的完全培养液，取每组细胞悬液各100 μl加入到上室。放置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，吸除小室上室的培养液，小心用棉签擦掉附着在小室内侧的未穿膜的细胞。收集各组中下室的细胞，在显微镜下计数，计算细胞迁移数。

1.7Western印迹检测细胞中β-catenin、C-myc、MMP-9、MMP-2表达水平 取Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535浓度为20 μmol/L的培养液培养48 h后的U251细胞，提取细胞中的总蛋白。用BCA定量检测试剂盒检测蛋白浓度。蛋白与上样缓冲液煮沸3 min后进行SDS-PAGE电泳(每个上样孔中加入50 μl变性蛋白样品)，80 V电压下观察溴酚蓝进入分离胶和浓缩胶边缘时改用120 V电压直至溴酚蓝进入到分离胶边缘。4℃转膜90 min。用5%脱脂奶粉封闭后，依次与一抗(600倍稀释)、二抗(1 000倍稀释)反应，显色曝光，以β-actin作为内参，分析计算目的蛋白的水平。

1.8统计学方法 应用SPSS22.0软件行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1细胞增殖检测结果 抑制剂组细胞存活率〔(62.34±2.54)%〕明显低于对照组〔(100.00±3.17)%〕(P<0.01)。

2.2细胞迁徙和迁移能力检测结果 见表1。抑制剂组细胞迁徙率、迁移细胞数目和MMP-2、MMP-9表达水平均明显低于对照组(P<0.01)，提示Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535能够抑制胶质瘤细胞的迁移能力。

2.3细胞中β-catenin、C-myc表达水平检测结果 抑制剂组中β-catenin、C-myc表达水平(0.28±0.03,0.57±0.06)明显低于对照组(0.69±0.08,0.98±0.06)(P<0.01),提示Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535能够抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。

表1 细胞迁徙率、迁移细胞数目及MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平

与对照组比较：1)P<0.01

3 讨 论

Wnt/β-catenin信号通路是一个高度保守的信号通路，在胚胎发育、组织器官形成过程中均具有重要作用。Wnt/β-catenin信号通路能够通过激活β-catenin，进而导致β-catenin在细胞核内聚集，影响靶基因的转录和表达，调控细胞的生长过程〔4〕。在正常情况下，Wnt/β-catenin信号通路处于抑制状态，β-catenin与细胞内的其他蛋白以复合物的形式存在，当受到某些条件刺激后，泛素蛋白酶依赖的蛋白降解途径被激活，导致细胞内β-catenin复合物被降解β-catenin表达升高〔5〕。Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤有密切关系，在肝癌、鼻咽癌、舌鳞癌等多种癌症中均发现有β-catenin的过度表达情况，当Wnt/β-catenin信号通路抑制剂作用后的肝癌细胞生长、迁移能力均明显降低〔6〕。FH535作为Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，能拮抗β-连环蛋白的转录〔7〕。本研究说明20 μmol/L的FH535能够抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。另外FH535作用后的脑胶质瘤细胞存活率明显降低。提示抑制Wnt/β-catenin信号通路能够抑制脑胶质细胞的增殖。

肿瘤的转移与肿瘤细胞的迁移有关。肿瘤细胞在受到特异性的迁移信号作用后，能够产生移动，而细胞外基质的降解是肿瘤细胞转移的重要组成部分〔8〕。细胞迁移过程受到MMP家族的作用，MMP-2、MMP-9能够降解Ⅳ型胶原酶〔9〕。有研究表明，MMP-2、MMP-9在肿瘤的转移过程中发挥重要作用〔10〕。本研究结果发现，FH535作用后的脑胶质瘤细胞迁徙能力、迁移能力均明显降低，而细胞内的MMP-2、MMP-9表达水平也明显下降，提示FH535能够抑制脑胶质瘤细胞的迁移能力，作用机制与MMP-2、MMP-9有关。

1Ruan S，Chen J，Cun X，etal.Noninvasive in vivo diagnosis of brain glioma using RGD-decorated fluorescent carbonaceous nanospheres〔J〕.J Biomed Nanotechnol，2015；11(12)：2148-57.

2Hofsteen P，Robitaille AM，Chapman DP，etal.Quantitative proteomics identify DAB2 as a cardiac developmental regulator that inhibits WNT/β-catenin signaling〔J〕.Proc Nat Acad Sci，2016；113(4)：1002-7.

3Beaulieu JF.Tuning WNT-β-catenin signaling via BCL9 proteins for targeting colorectal cancer cells〔J〕.E Biol Med，2015；2(12)：1846-7.

4Arques O，Chicote I，Puig I，etal.Tankyrase inhibition blocks Wnt/β-catenin pathway and reverts resistance to PI3K and AKT inhibitors in the treatment of colorectal cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2016；22(3)：644-56.

5Senapedis WT，Donovan S，Golan G，etal.PAK4 allosteric modulators (PAMs) repress the Wnt/β-catenin signaling pathway and tumor growth〔J〕.Cancer Res，2015；75(15 Suppl)：5404.

6Ganju A，Gara R，Kumari S，etal.Ormeloxifene attenuates wnt/β-catenin signaling in colon cancer cells by modulation of PKD1 and glycolytic pathways〔J〕.Cancer Res，2015；75(15 Suppl)：2072.

7Liu L，Zhi Q，Shen M，etal.FH535，a β-catenin pathway inhibitor，represses pancreatic cancer xenograft growth and angiogenesis〔J〕.Oncotarget，2016；7(30)：47145.

8吕会来，张 丽，温士旺，等.微小 RNA-126 在食管癌组织中的表达及其对食管癌 EC109 细胞增殖和迁移的影响〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(10)：2332-4.

9Nakamura K，Sawada K，Kinose Y，etal.Exosome transfer from ovarian cancer cells to mesothelial cells promotes cell invasion by upregulating MMP-9 secretion and increasing clearance of mesothelial cells〔J〕.Cancer Res，2015；75(15 Suppl)：5060.

10杨 晟，刘声财，陈文华，等.1，25-(OH) _2VitD_3 对人胰腺癌细胞侵袭迁移能力及 MMP-2，9，14 表达的影响〔J〕.山东医药，2016；56(34)：17-9.

〔2017-06-07修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

R739.41

A

1005-9202(2017)18-4474-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.018

甘肃省自然科学基金项目(1606RJZA201)

赵贤军(1972-)，男，博士，副主任医师，主要从事颅脑肿瘤、脑血管疾病研究。