c-Jun氨基末端激酶在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及机制

蔡金凤 陈 燕 张 晨 柳 达

(石河子大学医学院第一附属医院老干二科，新疆 石河子 832000)

c-Jun氨基末端激酶在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及机制

蔡金凤 陈 燕 张 晨 柳 达

(石河子大学医学院第一附属医院老干二科，新疆 石河子 832000)

目的探讨 c-Jun氨基末端激酶(JNK)在大鼠脑缺血再灌注(CIR)损伤中的作用。方法构建CIR大鼠模型，同时在大鼠脑侧室给予JNK抑制剂-SP600125抑制JNK的激活。采用5分制对造模后的大鼠行为学评分，用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色分析大鼠CIR后脑梗死体积。原位末端标记(TUNEL)法检测大鼠脑组织中神经细胞凋亡情况，Western印迹检测大鼠脑组织中B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bax、裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(酶切-caspase)3、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、JNK蛋白表达水平。结果模型组CIR损伤后3、24、72 h行为学评分均明显高于假手术组(P<0.01)，说明成功构建了大鼠CIR模型。实验组CIR损伤后3、24、72 h行为学评分均明显低于模型组(P<0.01)。脑梗死再灌注后3、24和72 h模型组大鼠脑组织中脑梗死体积、细胞凋亡率均明显高于假手术组，实验组均明显低于模型组(均P<0.01)。模型组脑组织中Bax、酶切-caspase3蛋白表达水平均明显高于假手术组，Bcl-2蛋白表达水平明显低于假手术组(P<0.01)。实验组中Bax、酶切-caspase3蛋白表达水平均明显低于模型组，Bcl-2蛋白表达水平明显高于模型组(均P<0.01)。实验组JNK的表达水平低于模型组(P<0.01)。模型组大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α水平均明显高于假手术组，实验组均明显低于模型组(均P<0.01)。结论抑制JNK激活可以减轻大鼠CIR损伤，作用机制可能与Bcl-2、Bax、酶切-caspase3表达有关。

脑缺血再灌注；c-Jun氨基末端激酶(JNK)；脑梗死体积；细胞凋亡

脑缺血再灌注(CIR)损伤是由于多种原因引起的脑部血流供应不足而形成〔1〕，脑缺血4.5 h后如果血液供应恢复，细胞会产生一系列的反应引起CIR损伤〔2〕。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白家族的成员之一，JNK的激活与细胞凋亡具有密切关系〔3〕，研究表明，在CIR损伤中JNK异常激活〔4〕。本研究构建大鼠CIR损伤模型，抑制模型中JNK的激活，探讨JNK的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：4月龄SD雄性大鼠54只，购于新疆石河子大学医学院，体重260～300 g。主要仪器及试剂：二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司；JNK抑制剂-SP600125购于上海高创化学科技有限公司；原位末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒购于上海前尘生物科技有限公司；B细胞淋巴瘤(Bcl)-2单克隆抗体、Bax单克隆抗体、白细胞介素(IL)-1β单克隆抗体、裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(酶切-caspase)3单克隆抗体、肿瘤坏死因子(TNF)-α单克隆抗体、GAPDH单克隆抗体均购于美国CST；显微镜购于美国Thermo。

1.2CIR动物模型构建 实验分为假手术组、模型组和实验组，每组18只大鼠。每组每个时间点分为一个亚组，每个亚组6只大鼠。3组大鼠造模前12 h禁食，不限制饮水。大鼠均按照3.5 ml/kg的剂量用浓度为10%的水合氯醛麻醉，10 min后观察大鼠完全麻醉并固定到鼠板上小心减掉大鼠颈部和前胸部毛。在大鼠正中线偏左位置纵向切开，用小脚弯镊在切口处将皮下的筋膜、甲状腺、肌肉剥离，把气管周围的组织剥离干净，找到颈总动脉(CCA)。沿着气管左侧分离血管后在颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)分叉处分离迷走神经和血管，将手术线穿过CCA、ICA、ECA，在CCA的近心脏端进行结扎。在ICA和ECA分叉处用手术线结扎ECA，用微动脉夹将ICA夹闭。在CCA形成分叉大约4 cm处纵向刺一个孔，将拴线自CCA沿分叉处小心插入，插入深度大约为11 cm时扎紧ICA的手术线，缝合伤口后30 min将拴线拉退到CCA处，将大鼠在37℃的环境下平放2 h，待大鼠苏醒后把拴线抽出来，用Willis环对大鼠实现动脉缺血后再灌注。假手术组只暴露大脑中动脉后不插入拴线，其他步骤同模型组和实验组。假手术组和模型组在CCA夹闭前30 min在脑侧室分别给予10 ml/L的二甲基砜(DMSO)溶液10 μl，实验组给予含有JNK抑制剂-SP600125的DMSO溶液10 μl。

1.3行为学评分 大鼠行为学评分按照5分制评分标准：大鼠术后可以自由活动，没有表现出任何异常症状计0分；大鼠术后前爪不能自由伸展计1分；大鼠术后出现不自主的转圈计2分；大鼠不能正常直立，不自主倾倒计3分；大鼠丧失意识计4分。

1.42，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测脑梗死体积 将大鼠断头处死，在冰上分离出脑组织。放置于-20℃冰箱30 min后切片，厚度约2 mm。将脑组织切片放置于1%的TTC溶液中，置于37℃孵育染色50 min，4%多聚甲醛缓冲液固定。正常组织会被染成粉红色，脑缺血组织中不被着色，呈现白色即为脑梗死区域，用图像分析软件计算每组大鼠脑组织的脑梗死体积。

1.5脑组织神经细胞凋亡情况检测 将脑组织切片放置于二甲苯中浸泡20 min，依次在95%、90%、80%、70%的浓度梯度酒精中浸泡5 min。用组化笔在切片组织周围画个圈，在圈内滴加蛋白酶K溶液，放置于室温下孵育反应15 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次5 min。甩干后在圈内滴加破膜工作液，放在室温下静置10 min，PBS洗涤后滴加TUNEL染液，放在湿盒内，37℃反应50 min后，PBS洗涤后甩干，在切片上加4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，置于避光条件下室温孵育反应10 min。PBS洗涤3次后封片。在倒置显微镜下选择相同的5个视野，分析细胞凋亡情况。

1.6Western印迹检测Bcl-2、Bax、酶切-caspase3、IL-1β、TNF-α表达水平 取大鼠CIR 24 h的大鼠脑组织，剪碎后转移到匀浆器中，在组织中加入冰预冷的含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液，取2 ml裂解液加入匀浆器中，置于冰上研磨。转移组织研磨液至离心管中，14 000 r/min，4℃离心10 min。吸取蛋白上清液至新的EP管中，用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测提取的蛋白浓度。取适量的蛋白与上样缓冲液充分混合后，100℃煮沸5 min，取变性蛋白加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上样孔中，每孔加入变性蛋白样品50 μl。80 V电压电泳30 min后调整为120 V电压直到电泳结束，取出蛋白凝胶按照常规方法4℃转膜2 h。取出转印后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，加入5%脱脂奶粉封闭液中封闭后，依次与一抗(500倍稀释)、二抗(1 000倍稀释)孵育后PBS洗涤，滴加显色液，在暗室中曝光，分析蛋白表达水平。

1.7统计学处理 采用SPSS22.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1大鼠行为学评分 模型组CIR损伤后3、24、72 h行为学评分均明显高于假手术组(P<0.01)，说明成功构型。实验组均明显低于模型组(P<0.01)。且CIR损伤后24 h大鼠行为学评分最高。见表1。

2.23组脑组织中脑梗死体积及细胞凋亡率比较 模型组脑梗死再灌注后3、24和72 h大鼠脑组织中脑梗死体积、细胞凋亡率均明显高于假手术组，实验组均明显低于模型组(均P<0.01)。见表1。

表1 3组大鼠CIR后行为学评分、脑梗死体积、细胞凋亡率比较

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；下表同

2.3大鼠CIR后24 h脑组织中Bcl-2、Bax和酶切-caspase3蛋白表达水平比较 模型组脑组织中Bax、酶切-caspase3蛋白表达水平均明显高于假手术组，Bcl-2蛋白表达水平明显低于假手术组。实验组Bax和酶切-caspase3蛋白表达水平均明显低于模型组，Bcl-2蛋白表达水平明显高于模型组(P<0.01)。见表2，图1。

图1 大鼠脑组织中Bcl-2、Bax、酶切-caspase3 蛋白表达结果

组别Bcl-2Bax酶切-caspase3假手术组1.12±0.130.15±0.090.13±0.02模型组0.21±0.101)0.85±0.241)0.56±0.161)实验组0.46±0.122)0.40±0.122)0.24±0.032)

2.4Western印迹检测细胞中IL-1β、TNF-α、JNK表达水平 模型组IL-1β、TNF-α水平均明显高于假手术组(P<0.01)，实验组均明显低于模型组(均P<0.01)。实验组JNK表达水平低于模型组(P<0.01)。见图2，表3。

图2 大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α蛋白表达

组别TNF-αIL-1βJNK假手术组0.13±0.040.12±0.0376.57±0.06模型组0.87±0.061)1.03±0.131)78.98±0.07实验组0.51±0.072)0.41±0.082)0.09±0.022)

3 讨 论

近年来，对CIR损伤的发病机制研究主要集中在自由基、钙超载、生物膜损伤、白细胞作用等方面〔5〕。JNK作为一种可以调控细胞增殖、凋亡、应激等生物学特性的蛋白激酶，在脑缺血损伤组织中过度激活〔6～8〕。本研究结果说明抑制JNK的激活可以减弱大鼠CIR损伤，降低大鼠脑组织中脑梗死的体积。CIR发生过程中脑组织神经元细胞凋亡是造成损伤的重要途径〔9〕，在细胞凋亡过程中，Bcl-2蛋白家族发挥重要作用〔10〕，根据作用不同，可以将凋亡相关蛋白分为促凋亡蛋白和抑制细胞凋亡蛋白〔11〕。Bcl-2在细胞凋亡过程中发挥抑制作用，而Bax发挥促进作用〔12，13〕，Cleaved-caspase3在Caspase级联反应中发挥凋亡执行的作用。本研究结果提示抑制JNK的激活可以有效抑制脑组织中的细胞凋亡。

炎性反应广泛存在于CIR损伤中，CIR损伤发生后大量中性粒细胞迅速聚集到损伤部位，而中性粒细胞的聚集会引起微循环的阻塞，对脑组织血液流通的恢复发挥阻碍作用〔14，15〕，当中性粒细胞聚集到脑组织缺血区域时，释放的蛋白分解酶和氧自由基具有加重CIR损伤的作用〔16〕。本研究结果提示抑制JNK可以减轻大鼠CIR损伤的炎症反应。

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〔2016-09-20修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

R743

A

1005-9202(2017)18-4472-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.017

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2012213A063)

蔡金凤(1984-)，女，硕士，主治医师，主要从事老年高血压、冠心病研究。