HPLC测定不同生长年限蒙古黄芪中黄芪甲苷含量

闫晋晋+姚妙+杨薪正+王信隆+廖国珍

摘 要：目的：探讨蒙古黄芪（AstragalusRadix）中黄芪甲苷的含量与生长年限的关系，为确定其最佳采收年限、保证药材质量控制、种质资源的评价及为了进一步明确其功效提供参考依据。方法：采用HPLC法测定不同生长年限的蒙古黄芪中黄芪甲苷的有效含量。色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相经过预实验确定为乙腈-水（35：65），最佳流速为1.0ml/min，最佳柱温为30℃。结果：不同生长年限的蒙古黄芪中黄芪甲苷含量发生明显变化，随着生长年限的增长，药材中黄芪甲苷含量基本呈上升趋势，该成分在1、2年生蒙古黄芪中含量较低，且2年生含量略微高于1年生的含量；3、4年生蒙古黄芪中含量出现明显升高的趋势，尤其是4年生含量急剧上升，幅度最大。5、6年生药材中其含量变化不大，且有微弱的下降趋势。结论：不同的生长年限蒙古黄芪中黄芪甲苷含量差异较大，应根据不同需求选择合适的采收时间。

关键词：蒙古黄芪；高效液相色谱法；黄芪甲苷；含量比较；不同生长年限

中图分类号：Q94 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2017）28-0085-03

黄芪系豆科植物膜荚黄芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.或蒙古黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongho-licus（Bge.）Hsiao.的干燥根茎[1]。为《中国药典》收录的常用中药材之一，较膜荚黄芪根部在生长过程中形态易产生鸡爪根的特点[2]，蒙古黄芪则相对稳定，近年来商品黄芪中多为蒙古黄芪。其性微温、味甘，具有补气固表、托毒排脓、敛疮生肌，利尿等生物活性。是玉屏风颗粒、颈舒胶囊、心通口服液[3]等著名中成药的原料药材之一，近年来，蒙古黄芪的消耗量逐年增加，已达年消耗量数千吨，今后市场需求量还将进一步释放。但同时也存在掠夺式的采挖，野生蒙古黄芪资源已濒临灭绝的现状，远远不能满足现代化生产的需要，因此人工驯化与栽培正在大规模种植。蒙古黄芪的主要活性成分之一为黄芪甲苷，具有提高人体免疫力、增强机体抗病能力[4]、提高机体抗应激能力、抗病毒[5]等多种功效。

近年来，有研究报道，黄芪甲苷还具有改善心肺功能[6]的功效，是蒙古黄芪的主要有效成分之一，同时还是评价黄芪药材质量[7]、药用价值的一项重要指标。目前，对蒙古黄芪在不同生长年限中黄芪甲苷的含量变化及规律的研究还未见系统的报道。为此，笔者在经过预实验的基础上，采用高效液相色谱法（HPLC）对陕西浑源县恒山周边广泛种植的6种不同生长年限的蒙古黄芪中的黄芪甲苷含量进行分析，以期为蒙古黄芪最佳采收期的确定、药材质量控制、种质资源的评价[8]及为了进一步明确其功效提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。1、2、3、4、5和6年生蒙古黄芪于2015年10月、2016年10月采自山西省大同市浑源县，均为人工驯化后栽培品种，经西安医学高等专科学校中草药鉴定专家许文友教授鉴定为蒙古黄芪[Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge. Var. MongholicusHsiaoBge.]的干燥根茎，去除须根后清洗干净并切片、烘干。

1.1.2 主要试剂黄芪甲苷对照品（批号：0781-200109），由西北农林科技大学中草药指纹图谱实验室提供，专供含量测定使用；经HPLC检测纯度≥98%；色谱乙腈，由上海化学试剂有限责任公司生产，批号为20060530；其他试剂均为由西安医专药学实验室提供的国产分析纯；水为购自人人乐超市的娃哈哈牌饮用纯净水。

1.1.3 主要仪器安捷伦Agilent1260LC高效液相色谱仪，由美国Agilent公司生产，同机配置有真空在线脱气机、六通阀进样器、柱温箱、Alltech ELSD 3300蒸发光散射检测器、Infinity四元梯度泵；Agilentchemstation化学工作站；KQ-250DE型超声波清洗器，由江苏昆山市超声仪器公司生产；RE-52AA型旋转蒸发仪，由上海亚荣仪器有限公司生产；SHZ-Ⅲ循环水式真空泵，由巩义市予华仪器有限责任公司生产；MettlerAE240电子天平，由梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产；FZ-102型微型植物样品粉碎机，由北京市永光明医疗仪器有限公司生产；电热恒温水浴锅，由北京市永光明医疗仪器有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制备精密称定干燥至恒重的黄芪甲苷对照品3.000mg，加甲醇10.00ml，制成浓度为300μg/ml的溶液，即得对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备将蒙古黄芪样品风干后粉碎，过60目筛，精密称取蒙古黄芪粉末4g，置于索氏提取器中，加入甲醇40ml，过夜，常温下加入适量的甲醇加热回流提取一次，提取液回收甲醇浓缩至干燥残渣，残渣用水（微热）溶解，然后水饱和的正丁醇振荡重复提取3次，并将正丁醇液合并，然后用20mL氨试液洗涤，重复2次，弃掉氨液，正丁醇液蒸干，再次用甲醇溶解并定容于5mL的容量瓶中，摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件。色谱柱，AgilentZORBAXSB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相为一定体积比的乙腈-水（35：65），流速设定为1.0ml/min，色谱柱温度设定为30℃。进样量5μL。黄芪甲苷对照峰的理论塔板数不低于4000，黄芪甲苷与其他成分出峰的分离度R均大于1.5，分离效果良好。

1.2.4 方法学考察

（1）线性关系考察对照品溶液按照浓度差精密吸取6份，按2、4、8、10、15、20μL分别注入高效液相色谱仪，按照“1.2.3”项下确定的色谱条件进样，计算峰面积后，用SPSS23.0软件计算x（对照品进样量的自然对数）y与（对照品峰面积的自然对数）的线性回归方程及相关系数R。endprint

（2）精密度试验根据“1.2.3”项下确定的色谱分离条件，精密吸取对照品溶液10μl，分5次连续进样，对每次峰面积的相对标准偏差RSD进行计算，以评价仪器的精密度。

（3）稳定性试验取同一种供试品溶液（编号 HS-07），精密吸取6份，每份10μl，按“1.2.3”项下确定的的色谱条件进样，时间段分别设定为0、2、4、8、16、24h，依次进行，对每个时间点的峰面积进行相对标准偏差RSD的计算，结果用来评价供试品溶液的稳定性良好程度。

（4）重复性试验选取同一蒙古黄芪样品（编号 HS-08），分别平行取样5次，按“1.2.2”项下确定的方法制备供试品溶液，然后按“1.2.3”项下确定的色谱条件依次进样，对每个样品峰面积的RSD进行计算，结果用来评价此方法的重复性。

（5）回收率试验选取已知黄芪甲苷含量的同一蒙古黄芪样品（编号 HS-08，3年生），精密称取药材样品6份，每份2 g，分别精密加入浓度为300μg/mL的黄芪甲苷对照品溶液各1mL，按“1.2.2”项下确定的方法制备供试品溶液，按“1.2.3”项下确定的色谱条件进行进样，计算测定结果的回收率及相对标准偏差RSD。

1.2.5 试样中黄芪甲苷成分含量的测定按照不同的生长年限，分别精密称取蒙古黄芪药材0.25g，供试品溶液的制备按照“1.2.2”项下确定的方法进行，进样的色谱条件按照“1.2.3”项下确定的进行，计算峰面积，根据“1.2.4.1”线性关系考察中建立的回归方程，计算得到蒙古黄芪样品中黄芪甲苷的准确含量。

2 结果与分析

2.1 对照品和供试品色谱分析结果

对照品和供试品色谱图见图1。由图中可知，按“1.2.3”项下确定的色谱条件，对照品和供试品均能达到较好的基线分离效果。

2.2 方法学考察结果

2.2.1 线性关系图2显示，以X（对照品进样量的自然对数）为横坐标，以Y（对照品峰面积的自然对数）为纵坐标，根据测定结果得出线性回归方程为Y=1.56123X+4.6983，r=0.9996，黄芪甲苷对照品的进样量在1.19～6.44μg范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度试验测得黄芪甲苷峰面积的相对标准偏差RSD=1.29%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验供试品溶液（编号 HS-07）中黄芪甲苷峰面积的RSD=2.42%。表明该供试品溶液能够在24h内保持基本稳定，符合试验要求。

2.2.4 重复性试验测得黄芪甲苷峰面积的RSD=2.01%，表明该测定方法的重复性良好。

2.2.5 回收率试验由表1可知，黄芪甲苷的平均回收率=98.21%，RSD=1.05%，表明方法准确、可靠，符合分析要求。

2.3 样品中黄芪甲苷含量

由表2可知，生长年限为1年的蒙古黄芪中黄芪甲苷的含量范围在0.051%～0.092%之间，生长年限为2年的蒙古黄芪中黄芪甲苷含量在0.091%～0.133%之间，生长年限为3年的蒙古黄芪中黄芪甲苷含量在在0.109%～0.212%之间，生长年限为4年的蒙古黄芪中黄芪甲苷含量在在0.112%～0.193%之间，生长年限为5年的蒙古黄芪中黄芪甲苷含量在在0.093%～0.192%之间。生长年限为6年的蒙古黄芪中黄芪甲苷含量在0.087%～0.186%之间。

3 结论与讨论

3.1 结论

从试验结果看，不同生长年限的蒙古黄芪中黄芪甲苷含量发生明显变化，随着生长年限的增长，药材中黄芪甲苷含量基本呈上升趋势，该成分在1、2年生蒙古黄芪中含量较低，且2年生含量略微高于1年生的含量；3、4年生蒙古黄芪中含量出现明显升高的趋势，尤其是4年生含量急剧上升，幅度最大。5、6年生药材中其含量变化不大，且有微弱的下降趋势。确定中药材最佳采收年限需从其产量和质量方面综合评估。因此，在综合考虑了最佳采收年限、产量质量和资源保护三方面的基础上，得出了以4年生采收最为适宜。此外，要确定人工栽培种植药材确切的生长年龄，在工作中有一定困难，在下一步的研究中，将对规范化种植后的药材进行采样，然后再使用该方法研究药材的最佳采收期，预期将会得出更为准确、可靠的结论，为黄芪资源的进一步开发与利用提供参考。

3.2 讨论

制备供试品溶液的方法选择 在预试验中分别测试了3种提取方法，分别是超声波提取、加热回流和索氏提取，对3种方法的提取效果进行比较后发现索氏提取法的提取效率最高。在选取索氏提取法后，又对溶剂（甲醇、氯仿、乙醇和石油醚等）、提取次数、提取时间及萃取次数等因数的提取效果進行了比较，试验结果表明，取甲醇作为提取溶剂，提取2次，正丁醇振荡提取3次，可将蒙古黄芪中的黄芪甲苷基本提取完全。从出峰时间和分离情况等因素综合分析，选择乙腈-水（35∶65）等强度洗脱时，保留时间最为适宜、易出对称峰且分离度良好（R>1.5）。

参考文献：

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[4]许杜娟，陈敏珠.黄芪总提物抗肿瘤作用及其机制研究[J].中华中医药杂志，2006，21（12）：771-772.

[5]胡明勋，郭宝林，周然，等.山西浑源仿野生栽培蒙古黄芪的质量研究[J].中草药，2012，43（9）：1829-1834.

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[8]田圣志，杨玉涛，张振凌，等.不同商品等级黄芪中黄酮类成分含量比较[J].中国中医药现代远程教育，2010，8（16）：189-190.endprint