,,Khalmetov Muratzhan,, ,
(北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京市食品风味化学重点实验室,北京 100048)
GC-MS、GC-O-MS结合感官评价分析牦牛奶粉风味组分
迟雪露,潘明慧,Khalmetov Muratzhan,孙宝国,王蓓,艾娜丝*
(北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京市食品风味化学重点实验室,北京 100048)
本实验以乙醚为萃取溶剂,采用同时蒸馏萃取法(SDE)提取牦牛奶粉中挥发性组分,结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)和气相色谱-嗅闻-质谱(GC-O-MS),对牦牛奶粉中风味物质定性定量分析。通过8名感官评价人员对牦牛奶粉进行感官评价,奶粉样品色泽良好,其中奶香味、奶油味和甜味比较浓郁,有微弱咸味和煮熟味,无苦味、酸味及涩味。GC-MS和GC-O-MS共同检测出21种挥发性物质,包括酮类8种,醛类3种,烯烃类3种,醇类2种,杂环类2种,酚类2种,醚类1种。其中醇和酮类物质含量较高,分别为46.85 μg/mL和38.63μg/mL。实验表明,GC-MS、GC-O-MS结合感官评价分析牦牛奶粉中的风味组分的方法是较为准确和高效的。
气相色谱-质谱联用(GC-MS),气相色谱-嗅闻-质谱(GC-O-MS),同时蒸馏萃取(SDE),牦牛奶粉,挥发性组分
牦牛(Bosgruniens)是世界上唯一的原种牛,具有较高的免疫性、抗逆性和快速适应性。中国的牦牛占世界牦牛总数量的95%以上,重点分布于我国海拔3000米以上的青藏高原[1-2]。牦牛日产鲜乳仅1~2 kg,仅有30%可以被采集,因稀少而珍贵。牦牛乳是一种天然的浓缩乳,其中钙、必需氨基酸、维生素A、C、D、E、B1和B12的含量都高于普通牛乳[3],牦牛乳中所含的铁、锌、锰、硒元素、乳铁蛋白含量和免疫球蛋白含量甚至超过母乳,因此牦牛乳营养而可贵[4-6]。有研究表明,牦牛乳中丰富的功能和生物活性成分,可能对于高原环境生活的牧民的健康状况发挥积极作用[7-8]。
目前,国内外针对牦牛奶粉的研究多是营养方面[9],而就牦牛奶粉风味方向挥发性组分的研究未见报道。食品中挥发性组分通常采用GC-MS技术进行鉴定,而在检测前对挥发性组分分离和浓缩的方法比较多,有同时蒸馏提取法(SDE)[10]、溶剂辅助风味蒸发(SAFE)[11]、固相微萃取法(SPME)[12]、吹扫捕集法(P&T)[13]和液相微萃取法(LPME)[14]等。SDE法提取挥发性组分只需少量溶剂就可以提取大量样品,重复性良好,萃取量较高。其缺点是长时间高温作用可能对热敏性的香气组分有影响。牦牛乳经过预处理、标准化、浓缩、喷雾干燥后制得牦牛奶粉,加工过程中经高温喷雾干燥处理,使SDE法中的同时蒸馏加热条件对奶粉中挥发性物质的影响较小。GC-O-MS作为一种感官检测技术,把气相色谱的分离能力和人类鼻子敏感的嗅觉相结合,能快速准确的进行定性分析。本文以牦牛奶粉为研究对象,采用SDE法提取,结合GC-MS和GC-O-MS分析初步鉴定牦牛奶粉中的挥发性组分,为后续优化生产工艺和提升产品感官品质提供科学的理论依据。
1.1材料与仪器
燎原全脂加糖牦牛奶粉(蛋白质含量19.0%,脂肪含量22%,碳水化合物含量51.5%,蔗糖含量10.5%) 甘肃燎原乳业有限责任公司;黄油 上海安普科技有限公司提供;巴氏全脂鲜牛乳(脂肪和蛋白含量分别为3.7%和3.1%)及含脂量为4.4%的纯牛乳 北京物美超市;蔗糖、NaCl、单宁、柠檬酸均为食品级,咖啡因(CAS号:58-08-2),纯度≥99%,无水硫酸钠(分析纯)及乙醚(分析纯) 北京华瑞科技有限公司;2-甲基-3-庚酮、C6~C30正构烷烃(色谱纯) 美国Sigma-Aldrich公司;氦气(纯度99.9%) 北京氦普北分气体工业有限公司提供。
气相色谱-嗅闻-质谱(ISQ1310) 美国Thermo Fisher公司;气相色谱嗅闻检测器 德国Gerstal公司;气相色谱-质谱联用仪(Agilent 7890-5975) 美国安捷伦科技有限公司;同时蒸馏萃取装置、Vigreux韦氏分馏柱 肯堡博美(北京)实验器皿有限公司;集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S) 巩义市予华仪器有限责任公司;电子分析天平(ME104) 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.2实验方法
1.2.1 奶粉感官评价 感官评价中每一个属性的评分标准为0~5分,参照标准按照表1准备。感官评价人员(男性4名,女性4名,年龄:22~30岁)先品评每一属性对应的参照标准样品,确定每一属性参照标准感官评分为5时对应属性的感官强度,然后评价待测样品并进行打分。0分为无任何感官属性强度,5分为等同于参照标准的感官属性强度。收集8名感官评价人员的数据结果,统计并绘制测试样品的感官评价雷达图。
表1 牦牛奶粉的感官评价属性及其感官评价描述性语言Table 1 Descriptive sensory language and attributes for yak milk powder
1.2.2 SDE法提取奶粉中挥发性组分 取50.0 g牦牛奶粉样品于1L圆底烧瓶中,加入200 mL 65 ℃超纯水进行溶解,加入转子,连接SDE装置重相端,置于磁力搅拌器中央120 ℃油浴。取70 mL重蒸乙醚于250 mL圆底烧瓶,连接SDE装置轻相端,45 ℃水浴。从第一次回流开始计时,连续提取3 h,提取完成后收集合并U型管中乙醚于溶剂烧瓶,加入40.0 g无水硫酸钠,置于4 ℃冰箱中冷藏过夜。过滤后用韦氏分馏柱蒸馏浓缩至1 mL。密封后置于4 ℃冰箱中,待分析。
1.2.3 内标法定量分析 取192 μg/mL的2-甲基-3-庚酮标准样品10 μL加入990 μL挥发性组分浓缩液中,得到加入内标物浓度为1.92 μg/mL的样品,漩涡混合振荡10 s,取0.2 μL进样。
根据添加内标物浓度、色谱峰面积以及未知组分的色谱峰面积之间的关系,根据公式可以计算出每一种挥发性组分的浓度。
式中:Ci是未知组分的浓度(μg/mL),Si是未知组分的色谱峰面积,CA是内标化合物的浓度(μg/mL),SA是内标化合物的色谱峰面积。
1.2.4 GC-MS分析 GC-MS条件:HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm),进样口温度250 ℃。
升温程序:起始柱温40 ℃,不保持,以5 ℃/min升温到220 ℃,保持4 min,载气为氦气,流速1 mL/min,进样量0.2 μL,分流比10∶1。
质谱条件:电子轰击(Electron Impact,EI)离子源;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;四级杆温度150 ℃;质量扫描范围30~350 u;扫描方式为全扫描;溶剂延迟5 min;调谐文件为标准调谐。
1.2.5 保留指数定性分析 在分析样品中添加C6~C30的正构烷烃内标物,根据公式进行计算。
式中:RTi为待测组分的调整保留时间,其中RTn 图2 牦牛奶粉样品的总离子流图Fig.2 TIC of volatile compounds obtained from yak milk powder注:A图为牦牛奶粉样品总离子流图;B、C、D分别为保留时间为5~10、10~20和20~40 min内出峰情况。 1.2.6 GC-O分析 GC-O是由气相色谱-质谱(ISQ1310)和嗅闻(ODP3)装置组成。采用GC-O对奶粉中挥发性风味成分进行分析。由8名经过训练的实验人员在嗅闻端口记录所闻到挥发性组分的香味描述和保留时间,必须有3名以上实验人员同时嗅闻到才能被确定为风味活性组分。 GC-O-MS条件:DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm),进样口温度250 ℃。 升温程序:起始温度40 ℃,不保持;以5 ℃/min升温到220 ℃,保持4 min;载气为氦气,流速1 mL/min;进样量1 μL,分流比1∶100。溶剂延迟8 min。 1.3数据分析 感官评价结果及GC-MS得到的数据进行统计分析,实验数据(平均值以及标准偏差)采用Microsoft office 2016进行整理;总离子流图采用Origin 8.0进行绘制;实验结果分类含量图使用Sigma Plot 10.0软件分析作图。 2.1感官评价结果分析 从牦牛奶粉感官评价雷达图(图1)中可以看出,测试样品色泽更深,并且有轻微的煮熟味,这可能是由于喷雾干燥的高温对风味产生了影响,同时也在一定程度上加深了奶粉的颜色。感官评价结果表明奶香味和甜味都非常浓郁,样品牦牛奶粉为全脂加糖奶粉,脂肪含量和蔗糖含量都很高。因此,这个结果和牦牛奶粉营养成分表提供的各项指标基本一致。正常乳粉有令人愉悦的味道,并伴有微弱的奶油味和咸味感。脂肪水解的主要产物是脂肪酸、甘油单酯和甘油二酯,这些产物中的短链脂肪酸,如丁酸、己酸等会产生强烈的令人不愉快的气味:哈喇味、苦味等[20]。测试样品中没有苦味、酸味和涩味,说明测试样品品质良好。 图1 牦牛奶粉的感官评价雷达图Fig.1 The sensory evaluation of radar map of yak milk powder 2.2挥发性组分的种类及含量 根据GC-MS获得的牦牛奶粉样品总离子流色谱图(图2)对样品中挥发性组分进行分析鉴定。分离出的化合物首先与NIST2011和DEMO标准谱库结合人工手动解谱分析进行匹配鉴定,选择匹配度大于80的化合物,用校对保留指数法进行确认[21],同时结合质谱裂解规律进行人工谱图解析,对结果进行补充。各组分含量通过内标法进行计算。根据牦牛奶粉样品的总离子流图可以看出,挥发性组分的出峰时间相对靠前,主要集中在前30 min,保留时间在30 min之后的峰经鉴定绝大部分不是奶粉中的物质,可能是由色谱柱柱流失产生的硅氧烷化合物。 牦牛奶粉中挥发性组分定性定量分析结果(表2)表明GC-MS一共鉴定出24种化合物,其中醇类2种,酮类9种,酚类2种,酯类2种,醚类1种,醛类3种,杂环类2种,烯烃类3种。从化合物的数量上来看,牦牛奶粉中的主要物质是酮类物质,不同种类的化合物会产生不同的香气,各种香气相互协调会使牦牛奶粉的风味更加饱满。从各类化合物含量上来看,含量最高的是醇类,含量为46.85 μg/mL,其次是酮类38.63 μg/mL,醛类10.03 μg/mL,杂环类1.35 μg/mL,烯烃类1.27 μg/mL,醚类0.46 μg/mL,酚类1.47 μg/mL,酯类1.16 μg/mL。牦牛奶粉中挥发性物质分类含量图(图3)可知,检测到的组分中醇类占46.30%,酮类占38.14%,其次是醛类占9.92%、杂环类占1.34%,还有少量的烯烃、醚及酚。检测到的牦牛奶粉挥发性组分中,辛醛、壬醛、柠檬烯以及2-庚酮等化合物是奶粉中较为常见的主要风味物质,阈值较低,对奶粉的整体风味有着极为重要的作用[22]。含量最高的化合物是糠醇,糠醇带有独特的焦糖香气,存在于大部分热加工产品中。 表2 牦牛奶粉中挥发性组分定性定量结果Table 2 Qualitative and quantitative analysis results in yak milk powder 注:定性方法中:MS为质谱分析法,RI为保留指数法(HP-5),气味为气相色谱-质谱-嗅闻分析法。 图3 牦牛奶粉中挥发性物质分类含量图Fig.3 Classification and content of volatile compounds yak milk powder 2.3挥发性组分的GC-O-MS分析 GC-O-MS借助人的嗅觉来识别芳香化合物,参加嗅闻评价的小组成员需要预先接受训练,以便于在嗅闻实验过程中遇到相似气味时使用相同或相近的语言进行描述。在嗅闻期间可能会出现气味持续时间太短暂而错过某个气味的情况,因此,实验员对嗅闻端口闻到的气味进行气味描述,至少3个实验员同时闻到,气味才予以确认[23]。风味物质经过色谱柱分离以后,分别进入质谱检测器和嗅闻仪,嗅闻人员记录风味描述特征,结果如表3所示。由表3可知,牦牛乳粉的风味主要以奶油味、焦糖味、水果香、花香、甜味、青草味,烟熏香等风味为主,这些风味主要是由酮类、呋喃类,醛类及烯烃类等释放出来,这些物质主要来源于牦牛乳成分在热加工过程中风味风味前体物质的降解及相互之间的化学反应引起。从气味描述来看,酮类物质多具有奶香、脂肪香以及水果香,对奶粉的整体风味有重要贡献[24]。乳脂肪中挥发性脂肪酸易发生自动氧化、水解、脱羧等反应,从而生成酯类、羰基化合物和呋喃等一系列芳香化合物,如壬醛,是乳制品中常见的风味化合物,带有柑橘香和花香,它是奶粉中油酸氧化的基本产物,可以作为衡量奶粉氧化变质程度的标志物[25]。牦牛乳粉在加热过程中会发生美拉德反应,其热诱导挥发物包括糠醛、呋喃衍生物、二羰基化合物等风味物质[26],如2-乙基呋喃,这类化合物会赋予奶粉焦糖的香气。挥发性组分中的杂环类芳香化合物可能是来自于Strecker降解[22],除了2-乙基呋喃带给奶粉的焦糖香气,苯并噻唑的烤香味也一定程度上丰富了奶粉的整体香气,具有多于6个碳原子的烷醛和烯醛以及酮是通过脂质氧化产生的典型挥发物,如辛醛、壬醛、2-十一酮和2,4-癸二烯等,这些化合物通常带有水果香气。此外,挥发性组分中硫化物如二乙基二硫醚,带有不愉快的刺激气味,可能是来自半胱氨酸和蛋氨酸的裂解以及微生物代谢反应。表3中除了以上分析的物质之外,还检测到邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯及2,5-双(1,1-二甲基乙基)苯酚三种物质,有关奶粉风味物质的研究文献中并未报道此三类物质为奶粉中的挥发性组分[22,26],但其它文献表明,邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯及2,5-双(1,1-二甲基乙基)苯酚三种物质是中草药中常见的挥发性组分[27-28],在牦牛奶粉中检测到这三种物质,可能是因为牦牛属于半野生畜种,在高原地区以放牧采食为主,牧草中存在的天然药材以饲料的形式通过迁移出现在牦牛乳粉中。 表3 GC-O-MS鉴定牦牛奶粉中的挥发性物质Table 3 Identification of volatile compounds in yak milk powder by GC-O-MS 本文采用SDE法提取牦牛奶粉中的挥发性组分,提取过程中,样品与萃取溶剂共沸,使得样品一侧的温度保持在120 ℃左右,而牦牛乳粉中的不饱和脂肪酸的热降解反应需要在200~700 ℃下才能进行,因此本文所采用的SDE法不会导致牦牛乳粉中不饱和脂肪酸的热降解,结果的准确性得到保证。Karagül-Yüceer等人研究表明,在脱脂奶粉中检测到了乙酸、丁酸等短链脂肪酸以及有α-和β-羟基酸或甘油三酯通过加热形成的内脂,游离脂肪酸通常会赋予奶粉干酪味,而内脂有助于奶粉中的甜味和脂肪味的释放[26]。本实验中没有检测到酸类物质和酯类物质,这可能是由于不同的提取方法对检测结果也会有一定的影响。另外,本实验的原料是牦牛奶粉,牦牛的生存环境高寒恶劣,并且天然野牧,不需要人工补饲,在样品基质上可能与普通牛乳基奶粉存在差异。糠醇、2-庚酮、2-乙基呋喃、辛醛、柠檬烯、壬醛、2,4-癸二烯、2-十三酮等挥发性组分是奶粉中较为常见的风味物质,尤其是糠醇、壬醛这类热诱导产物是奶粉香气的主要贡献者。奶粉中挥发性组分检测结果显示,糠醇在牦牛奶粉中的含量最高,糠醇具有的焦糖味对牦牛奶粉的整体香气起到了不可替代的作用,检测到的醚类化合物以及烯烃类化合物的种类和含量虽然比较少,但是对牦牛奶粉的风味也起到一定的作用。 GC-MS和GC-O-MS两种方法共同检测到的挥发性化合物21种,主要为醇类、酮类物质,其次是醛类、酚类,还有少量的杂环类、烯烃类,说明两种方法在鉴定牦牛奶粉挥发性组分方面具有一致性。通过GC-O-MS检测到的物质比GC-MS检测到的挥发性物质少,这可能因为GC-O-MS方法、牦牛奶粉的制造工艺及其脂肪含量等对实验研究的结果产生影响。牦牛奶粉中挥发性组分成分复杂,可能存在一些不具有芳香气味或者一些阈值低但含量极少的物质。两种方法优势互补结合起来使用,能快速鉴定牦牛奶粉中挥发性组分,并且为后续对牦牛奶粉中风味活性物质研究提供参考。 [1]李亚茹,郝力壮,牛建章,等. 牦牛乳与其他哺乳动物乳功能性营养成分的比较分析[J]. 食品科学,2016,37(7):249-253. 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AnalysisofvolatileflavorcompoundsofyakmilkpowderbyGC-MS,GC-O-MScombinedwithsensoryevaluation CHIXue-lu,PANMing-hui,KhalmetovMuratzhan,SUNBao-guo,WANGBei,AINa-si* (Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China) In this study,we used simultaneous distillation extraction(SDE)to extract the volatile components of yak milk powder with ethyl ether as extraction solvent,and analyzed the volatile flavor compounds by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)and gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry(GC-O-MS). The sensory evaluation of yak milk powder was carried out by eight sensory evaluators,the results showed that the color of the sample was well,the flavor of milk,cream and sweet taste was intense. Meanwhile,the sample tasted a slight salty and cooked flavor,without bitter,sour and astringency flavor. In the yak milk powder,21 kinds of volatile compounds were detected by GC-MS and GC-O-MS simultaneously,including 8 ketones,3 aldehydes,3 olefins,2 alcohols,2 heterocycles,2 phenols,and 1 ether. Among them,alcohols and ketones were very abundant,the contents were 46.85 μg/mL and 38.63 μg/mL,respectively. This study indicated that the combination of GC-O-MS,GC-MS and sensory evaluation is very accurate and efficient on the analysis of yak milk powder’s flavor. gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);GC-olfactometry-mass spectrometry(GC-O-MS);simultaneous distillation extraction(SDE);yak milk powder;volatile components 2017-03-08 迟雪露(1992-),女,在读硕士研究生,研究方向:乳与乳制品风味,E-mail:chi_xl@163.com。 *通讯作者:艾娜丝(1986-),女,博士,讲师,研究方向:乳与乳制品风味,E-mail:ainasi@btbu.edu.cn。 “十三五”国家重点研发计划重点专项(2016YFD0401100);北京工商大学两科基金培育项目(LKJJ2017-22);北京工商大学青年教师科研启动基金资助项目(QNJJ2016-16)。 TS252.51 :A :1002-0306(2017)17-0235-06 10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.0452 结果与分析
3 结论