44批次不同来源国产沉香药材松香酸类物质的检测△

冯剑，刘洋洋*，魏建和，2*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所海南分所(海南省南药资源保护与开发重点实验室，国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室)，海南 海口 570311；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所(中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，濒危药材繁育国家工程实验室)，北京 100193)

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44批次不同来源国产沉香药材松香酸类物质的检测△

冯剑1，刘洋洋1*，魏建和1，2*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所海南分所(海南省南药资源保护与开发重点实验室，国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室)，海南 海口 570311；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所(中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，濒危药材繁育国家工程实验室)，北京 100193)

目的：考察不同来源的44批次沉香药材含松香酸类物质情况，为沉香药材正确使用提供依据。方法：建立超高效液相色谱法，并结合乙酸铜化学显色反应和薄层色谱法对沉香药材中松香酸类物质进行鉴别分析。结果：44批次不同来源的沉香样品中，药材市场所售10批次沉香药材中松香酸类物质检出率达40%；其余34批次沉香药材(包括19批次通体结香技术产沉香，5批次火烙法产沉香和10批次野生沉香)均未检出松香酸类物质。结论：采用通体结香技术等方法产的沉香药材和野生沉香不含松香酸类物质，但药材市场所售沉香药材有掺入松香酸类物质的现象。

沉香；松香酸；薄层色谱；超高效液相色谱

沉香为名贵药材，临床应用广泛，在我国160余种中成药、藏药、蒙药组方中使用，始载于梁代陶弘景的《名医别录》，被列为上品[1]。《中华人民共和国药典》收录的沉香来源于瑞香科Thymelaeaceae沉香属AquilariaLam.植物Aquilariasinensis(Lour) Gilg 含有树脂的木材，沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，主治胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急[2-3]。由于野生沉香资源短缺，沉香价格高，此外，中药材和中成药成分复杂，药品标准不能按照化学药品同样进行全成分检测，添加化学物质不易被识别，隐蔽性较强[4]。松香酸是松香的主要萜类化合物成分，具有特殊的香气，添加松香酸类物质可使沉香药材浸出物增大，不易被发现，大量服用对中枢神经有极大的损害[5]。吴萌等(2010)发现有用松香液浸泡的市售掺假沉香，张妤琳等(2011)和许伟帅等(2016)建立了沉香添加松香酸的鉴别方法[5-7]，其他中药材，如没药[8]、乳香[9]及中成药，如西黄丸[10]、冠脉宁片(胶囊)[11]、麝香接骨胶囊[12]、风湿关节炎片[13]也发现有添加松香酸类物质。文献报道中发现沉香药材中存在添加松香酸类物质，研究材料选择不具代表性，并未考虑不同来源(野生沉香和火烙香、通体香沉香等人工结香技术产沉香)的沉香药材是否存在添加松香酸类物质。目前，人工栽培的沉香主要以通体结香技术法、火烙法、半断杆法为主要的结香方法。而基于伤害诱导沉香形成机理的通体结香技术“Agar-Wit”在世界范围内应用最为广泛，该方法具有三高一稳定的特点[14-16]，采用通体结香技术极大的提高了沉香产量，且结香6个月的通体结香沉香药材可满足《中华人民共和国药典》的要求，结香20个月的沉香品质不低于野生沉香[17]；此外，火烙法也是国内种植生产沉香的主要方法。

本实验在现有文献报道的基础上，利用乙酸铜化学显色、薄层色谱(TLC)及超高液相色谱法(UPLC)技术，研究不同来源(通体结香技术法、火烙法、野生和市售)沉香中掺入松香酸的情况，旨在较全面的考察不同来源的沉香药材是否含有松香酸类物质，及评估通体结香技术法生产的沉香的质量，为沉香药材使用提供技术参考。

1 试药与仪器

1.1实验材料

沉香药材样品分别为通体结香技术、火烙法、打钉法等方法生产的沉香药材及野生沉香药材，共计44批次，详细信息见表1。所用沉香药材样品均由中国医学科学院药用植物研究所海南分所沉香鉴定中心标本馆提供，经中国医学科学院药用植物研究所魏建和研究员鉴定44批次沉香药材均为沉香属含有树脂的木材。沉香对照药材(121222-201102)和松香酸对照品(111938-201201)均购自中国食品药品检定研究院。

表1 实验用国产沉香药材基本信息

1.2仪器与试剂

超高效液相色谱仪(Waters ACQUITY UPLC-H Class)；色谱柱(ACQUITY UPLC BEH C18，50mm×2.1mm，1.7μm)。XS105DualRange 十万分之一电子天平，PL203千分之一电子天平(METTLER TOLEDO)；PS-40超声波清洗机、JY025型紫外分析仪、WH-S微型涡旋混合仪。

无水乙酸铜(AR，GOLD WHEAT公司)，石油醚60～90℃(AR，西陇化工股份有限公司)，乙酸乙酯(AR，西陇化工股份有限公司)，冰醋酸(AR，广州化学试剂厂)，乙腈(色谱纯，默克化工技术(上海)有限公司)、甲酸(AR，西陇化工股份有限公司)。实验用水为自制超纯水。

2 方法

2.1化学显色鉴别

取样品粉末1g，置具塞三角瓶中，加10mL石油醚(60～90℃)，涡旋振荡2min，0.45μm滤膜滤过，取滤液4mL，置试管中，加新配制的0.5%乙酸铜溶液4mL，涡旋10s，静置分层。

2.2薄层色谱鉴别

取样品粉末1.0 g，加石油醚(60～90 ℃)10 mL，涡旋振荡2 min，滤过，滤液浓缩至1 mL作为供试品溶液。取松香酸对照品5 mg，加石油醚(60～90 ℃)5 mL溶解，作为对照品溶液。按照《中华人民共和国药典》2015年版四部 0502薄层色谱试验，吸取上述供试品和对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(9∶1∶0.1)展开，取出，晾干。置紫外灯光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与松香酸对照品色谱位置，不得显示相应的淬灭斑点，再喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯(365 nm)下检视。

2.3超高效液相色谱鉴别

2.3.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色谱柱，流动相：乙腈-0.1%甲酸(75∶25)，检测波长：241 nm，柱温：30 ℃，流速：0.5 mL/min。

2.3.2 溶液制备 对照品溶液：精密称取松香酸对照品适量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.1 mg对照品的溶液。供试品溶液：精密称取样品粗粉1.0 g，精密加入甲醇20 mL，超声处理20 min，放冷，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

3 结果

3.1化学显色鉴别

利用松香酸能够充分地溶解在石油醚(60～90 ℃)等有机溶剂的性质，结合现配的乙酸铜溶液进行显色反应。按照“2.1化学显色鉴别”操作步骤，进行显色实验。结果表明，19批通体结香技术生产的沉香药材、10批野生沉香药材、5批火烙法生产的沉香药材均未检出松香酸，10批药材市场上购买的沉香中有4批检出松香酸，石油醚层显蓝绿色，同时设置以不添加样品为空白对照，以松香和1%松香+沉香混合物为阳性对照，该化学显色鉴别反应良好，结果见表2。

表2 化学显色鉴别结果

注：“+”表示石油醚层显示蓝绿色；“-”表示石油醚层显示无色；“CK”表示石油醚代替样品组。

3.2薄层色谱鉴别

按照“2.2薄层色谱鉴别”项操作步骤，对所有沉香样品开展薄层色谱鉴别。在紫外灯光(254nm)条件下检视，19批通体结香技术生产沉香样品(见图1)、10野生沉香样品(见图2)、5批火烙法生产的沉香样品(见图3)与松香酸对照品溶液相同位置上，没有显示相同颜色的荧光斑点，松香、1%松香+沉香样品与松香酸对照品溶液相同位置上，显示相同颜色的荧光斑点。10批市售沉香中有4批沉香与松香酸对照品溶液相同位置上，显示相同颜色的荧光斑点(见图4)。喷以10%硫酸乙醇溶液，烘干加热至斑点显色，置紫外灯(365nm)下检视，在相同的位置显示蓝色的荧光斑点，其结果有化学鉴别一致。

注：左：254 nm荧光检视；右：喷10%硫酸乙醇后365 nm检视；1～19为通体结香技术生产的沉香药材样品；sxs为松香酸，sx为松香，下同。图1 19批通体结香技术生产的沉香药材样品薄层色谱鉴别

注：左：254 nm荧光检视；右：喷10%硫酸乙醇后365 nm检视；20～29为野生沉香药材样品。图2 10批野生沉香药材样品薄层色谱鉴别

注：左：254 nm荧光检视；右：喷10%硫酸乙醇后365 nm检视；30～34为火烙法生产的沉香样品。图3 5批火烙法生产的沉香药材样品薄层色谱鉴别

注：左：254 nm荧光检视；右：喷10%硫酸乙醇后365 nm检视；35～44为市售沉香。图4 10批市售沉香药材样品薄层色谱鉴别

3.3超高效液相色谱鉴别

液相色谱鉴别是常见的定性和定量鉴别的方法，与相比普通液相比超高效液具有灵敏性高、样品用量少和检测时间短等优点。本文首次采用超高效液相色谱法对上述的44份沉香样品进行验证分析。按照“2.3超高效液相色谱鉴别”项的步骤，分别用0.45μm的滤膜过滤得沉香样品、松香酸样品及1%松香+沉香样品注入超高效液相色谱仪中1μL，记录色谱图。如图5松香酸对照品的出峰保留时间为2.929min，光谱扫描波长在239nm出有最大吸收峰AU=0.924，图6中19批通体结香技术生产沉香样品、10批野生沉香样品和5批火烙沉香未检测出与松香酸对照品出峰位置相同的松香酸吸收峰，10批市售沉香中有4批检测到了与松香酸对照品出峰位置相同的吸收峰，表明4批样品中有人为非法添加松香酸类物质。

图5 松香酸对照品色谱图及光谱扫描图

图6 沉香样品中松香酸检测色谱图

4 讨论与结论

沉香在医药、香精香料、宗教祭祀和工艺品收藏等方面应用广泛，国内外市场需求量巨大，价格日益俱增。市场上各类假冒伪劣沉香品泛滥，本研究发现44批次不同来源的沉香样品中，药材市场所售10批次沉香药材中松香酸类物质检出率达40%；其余34批次沉香药材(包括19批次通体结香技术产沉香，5批次火烙法产沉香和10批次野生沉香)均未检出松香酸类物质。与前人研究相比，本研究选择不同来源的沉香药材(野生沉香药材、通体结香技术生产的沉香药材、火烙法生产的沉香药材、打钉法生产的沉香药材)，较全面的考察了不同来源的是否添加松香酸类物质。明确了19批次采用通体结香技术生产的沉香药材没有添加松香酸类物质。通体结香技术可以免受象传统结方式对树体伤害大且所产沉香品质不稳定情况，能够生产出高质、高量和稳定的沉香，也是我国中药材沉香的标准对照药材的来源，采用通体结香技术等方法产的沉香药材和野生沉香不含松香酸类物质，但药材市场所售沉香药材有掺入松香酸类物质的现象。

此外，笔者已利用 UPLC-MS/MS和UPLC-Qtof进一步精准定性和定量考察，同时结合GC-MS分析沉香药材是否非法添加松香酸类物质。

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IdentificationofAbieticAcidfrom44DifferentKindsofChineseAgarwood

FENG Jian1，LIU Yangyang1*，WEI Jianhe1，2*

(1.Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization，Hainan Branch of the Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Haikou 570311，China;2.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China)

Objective：To identify abietic acid from 44 different kinds of Chinese agarwood，so as to provide the basis for the proper use.Methods：An UPLC method for determination of abietic acid was established，combining chemical color reaction of cupric acetate and TLC，the abietic acid in agarwood were identified and determined.Results：Abietic acid in 4 batches of commercially available agarwood samples，and the relevance ratios was 40%，the other 34 batches of agarwood were not detected.Conclusion：There is no abietic acid in the medicinal materials of agarwood induced by whole-tree agarwood-inducing technique，but the phenomenon of illegal incorporation of agarwood containing acids into the market is rather serious.

Agarwood；abietc acid；TLC；UPLC

国家自然科学基金(81403055)；海南省重大科技计划项目(ZDKJ2016004);海南省自然科学基金(20168369)

] 刘洋洋，副研究员，研究方向：中药质量控制、中药材标准研制研究，Tel：(0898)31589007，E-mail：eadchris@163.com;魏建和，研究员，研究方向：药用植物基因资源、分子育种与次生代谢产物调控研究，Tel：(010)57833016，E-mail：wjianh@263.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.004

2017-06-02)

*[