消疹止痒喷剂治疗EGFRI相关性皮疹的细胞学机制研究❋

程宗琦，陈 琳，姚 鑫，金 奕(1. 南京中医药大学，南京 1003； . 苏州大学附属第一医院，苏州 15006)

【实验研究】

消疹止痒喷剂治疗EGFRI相关性皮疹的细胞学机制研究❋

程宗琦1,2，陈 琳2，姚 鑫2，金 奕2
(1. 南京中医药大学，南京 210023； 2. 苏州大学附属第一医院，苏州 215006)

目的：探究消疹止痒喷剂对皮肤角质细胞增殖分化及巨噬细胞浸润的影响及其作用机制。方法： MTT法观察不同浓度消疹止痒喷剂对皮肤角质细胞HaCaT生长能力的影响；划痕实验(Wound healing)及Transwell实验考查消疹止痒喷剂对HaCaT及巨噬细胞RAW264.7运动能力的影响，采用western blotting实验考察消疹止痒喷剂对HaCaT细胞的PI3K、AKT、tPA、CD147及RAW264.7细胞中基质金属蛋白酶MMP-2(Matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、MMP-9 蛋白表达的影响，采用RT-PCR考察消疹止痒喷剂对RAW264.7细胞的MMP-2、MMP-9 mRNA水平的影响。结果：消疹止痒喷剂可以剂量依赖性地促进HaCaT细胞的增殖，抑制其分化；Wound healing实验和Transwell小室迁移实验中，随着消疹止痒喷剂浓度提高，HaCaT及巨噬细胞RAW264.7迁移数目呈递减趋势；随着消疹止痒喷剂浓度的提高，HaCaT及巨噬细胞RAW264.7侵袭能力呈递减趋势；消疹止痒喷剂可以剂量依赖性抑制HaCaT细胞PI3K和AKT增殖蛋白表达，同时降低分化蛋白tPA和CD147的表达；此外消疹止痒喷剂可以显著抑制RAW264.7 MMP2和MMP9的mRNA和蛋白水平表达。结论：消疹止痒喷剂促进皮肤角质细胞增殖并抑制巨噬细胞浸润是其治疗EGFRI相关性皮疹的重要机制之一。

消疹止痒喷剂；HaCaT；RAW264.7；增殖分化；迁移侵袭

表皮生长因子受体抑制剂(EGFRI)包括小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)和单克隆抗体[1]。EGFRI可改善晚期NSCLC患者的生活质量及总生存率已成为不争的事实。这类药物基本无传统细胞毒性药物的骨髓抑制、心脏毒性和神经毒性等，其主要副作用为皮肤不良反应，发生率大于50%，但大部分为轻中度，严重者约占10%[2]。一方面皮疹的出现可能是治疗获益的信号，多项临床研究发现，皮疹的严重程度与EGFRI治疗疗效呈正相关，皮疹患者的生存期显著优于未出现皮疹的患者。另一方面EGFRI相关皮肤不良反应可能干扰正常治疗，严重者甚至影响患者生活质量并导致治疗中断而影响疗效[3]。因此在不改变EGFRI治疗的前提下，有效控制皮肤不良反应具有重要意义。

EGFR在皮肤角质细胞增殖分化等方面起重要作用，即刺激表皮细胞生长、抑制其分化，保护细胞抵抗紫外线相关损伤，抑制炎症并加速创面愈合，如该作用被阻断便会导致EGFRI相关皮肤不良反应。EGF必须与EGFR结合形成二聚体，激活内源性酪氨酸蛋白激酶后，才能影响角质细胞的生长和维持[4]。酪氨酸蛋白激酶激活是细胞内信号反应的关键启动因素，调节细胞的增生、分化、生存和迁移以及血管生成与转移。EGF等配体也参与伤口愈合过程，如HB-EGF可加速角质细胞迁移，促进伤口愈合。皮肤EGFR缺失的基因工程小鼠，表现为干燥、指甲易碎和表皮变薄，且广泛的头发毛囊缺陷可导致头发纤细易断和毛囊混合性的炎症浸润、毛囊上皮破坏，以上反应与EGFRI引起的皮肤改变相似[2]。现代研究证实，EGFRI可抑制基底角化细胞EGFR的磷酸化，并减少Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK)的表达，从而导致皮肤正常角质细胞的生长抑制、提前分化及异常迁移，促使某些皮肤反应的发生。抑制EGFR介导的信号通路可引起生长抑制和凋亡、细胞迁移减少、细胞黏附和分化增加、炎症反应激活，进而影响角质细胞，导致特异性的皮肤表现[5]。

目前针对EGFRI靶向药物引发的皮肤不良反应，主要治疗手段多为局部使用抗生素、类固醇激素等，但因其疗效不理想、副作用大限制其临床运用[6]，因此寻找一种合理的方法治疗EGFRI相关性皮疹具有重要意义[7]。中药是我国的瑰宝，尝试从中药中寻找出针对疾病靶标的创新药物已成为当前的研究热点。在中医基础理论中，分子靶向药物所致皮肤毒性属于“药毒”范畴，表现为“肺热血瘀”，用宣肺凉血祛瘀中药可辨证论治。“消疹止痒喷剂”为我院自制中药制剂，由紫草、野菊花等5味中药组成，其中紫草功能清热凉血、解毒透疹，野菊花解毒消痈，地肤子清热利湿止痒，侧柏叶善清血热，冰片清热止痛，诸药合用达清热解毒、凉血止血、散瘀消肿之功效。前期开展的药理实验亦证实，其具有较好的抗炎消疹作用[8]。本研究利用皮肤角质细胞及免疫细胞在体外模拟EGFRI相关性皮疹发病机制，阐述“消疹止痒喷剂”治疗EGFRI相关皮肤不良反应的分子机理，为开发“消疹止痒喷剂”成为一种安全、有效治疗EGFRI相关性皮疹的复方制剂奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品

DMEM(美国Gibco公司 Cat. 12101-062 Lot. 758136)，胎牛血清(Hyclone公司Cat：SH30396.02 Lot. KPF21391)，MTT(Promega公司，Lot.30502302)。消疹止痒喷剂(苏州大学附属第一医院自制)，制剂原料药购自苏州市天灵中药饮片有限公司，经南京中医药大学巢建国教授鉴定，紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst.的干燥根，野菊花为菊科植物野菊ChrysanthemumindicumL.的干燥头状花序，侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladusorientalis(L.)Franco的干燥枝梢和叶，侧柏叶为藜科植物地肤Kochiascoparia(L.)Schrad.的干燥成熟果实，梅片为龙脑香科植物龙脑香Dryobalanops aromatica Gaertn. f.的树干提取结晶。PI3K兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.4257)，AKT兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.4685)，MMP-2兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.87809)，MMP-9兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.13667)，tPA兔一 抗(Santa Cruz公司，Lot.sc-59721)，CD147兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.13287)及GAPDH兔一抗(Cell Signaling Technology公司，Lot.5174)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 正常肝细胞LO2、角质细胞HaCaT、巨噬细胞RAW264.7购自上海中科院，HaCaT及RAW264.7细胞于含10%胎牛血清以及1×105IU·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中进行常规培养。LO2细胞于含10%胎牛血清以及1×105IU·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的1640培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中进行常规培养。

1.2.2 消疹止痒喷剂对LO2及HaCaT细胞增殖的检测 LO2细胞生长至80%融合，0.25%胰蛋白酶消化，1640完全培养基重悬、计数，接种于96孔板中，5×103个细胞每孔。待细胞单层贴壁后加入消疹止痒喷剂，测试最高浓度为100 μL·mL-1, 3倍稀释。对照组加入等体积的DMSO，每个药物浓度设3个复孔。将培养板放回细胞培养箱，24 h后加入20 μL MTT溶液继续在培养箱中孵育4 h。摇床避光震摇15 min，用全自动酶标仪在490 nm测定吸光度值(OD值)，结果以药物对吸光度值表示[9-10]。抑制率=(正常组OD值-加药组OD值)/正常组OD值。HaCaT细胞生长至80%融合，0.25%胰蛋白酶消化，DMEM完全培养基重悬、计数，接种于96孔板中，5×103个细胞每孔。待细胞单层贴壁后加入消疹止痒喷剂，使其终浓度为2 μL·mL-1、6 μL·mL-1、10 μL·mL-1。对照组加入等体积的DMSO，每个药物浓度设3个复孔。将培养板放回细胞培养箱，分别于24、48、72 h后加入20 μL MTT溶液，继续在培养箱中孵育4 h。摇床避光震摇15 min，用全自动酶标仪在490 nm测定吸光值(OD值)，结果以药物的吸光度值表示。乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自碧云天公司(Lot.C0017)。新鲜配制10 mU/ml、5 mU/ml、2.5 mU/ml、1.25 mU/ml、0.65 mU/ml、0 mU/ml浓度的LDH标准品，在酶标仪上用490 nm检测吸光度值并绘制标准曲线。对照组加入等体积的DMSO，设置2 μL·mL-1、6 μL·mL-1、8 μL·mL-1、12 μL·mL-1和16 μL·mL-1浓度孔(每组3个复孔)。将培养板放回细胞培养箱，24 h后收集每个样本培养液离心后收集上清，用新鲜细胞培养液稀释10倍，取50 μL加入到96孔板，加入试剂盒中LDH检测液，在酶标仪上用490 nm检测。通过标准曲线相应公式计算出测定样品中LDH的酶活性，根据测定结果对不同样品处理组的酶活性进行归一化处理。

1.2.3 消疹止痒喷剂对HaCaT增殖相关蛋白表达的影响 取对数生长期的HaCaT细胞用0.25%胰蛋白酶消化制成1×109·mL-1细胞悬液，接种于培养皿中，每个培养皿各加入1ml细胞悬液，其余为含10%胎牛血清的DMEM培养液，共10 ml体系。细胞分组及给药方式同上，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后提取蛋白，并采用BCA法测定蛋白浓度。变形后取50 μg上样，用10%分离胶、5%浓缩胶电泳：0.02A每块胶至溴酚蓝消失，之后转到PVDF膜上。一抗PI3K (稀释比例1∶1000，购自Cell Signaling Technology，货号4249)， AKT (稀释比例1∶1000，购自Cell Signaling Technology，货号4685)，tPA (稀释比例1∶1000，购自Santa Cruz Biotechnology，货号sc-59721)及CD147 (稀释比例1∶1000，购自Cell Signaling Technology，货号13287)，4 ℃孵育过夜后加1∶10000辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG，加入化学发光试剂，用Kodak胶卷曝光；以GAPDH (稀释比例1∶1000，购自Cell Signaling Technology，货号5174)作为内参作灰度分析，实验重复3次。

1.2.4 消疹止痒喷剂对HaCaT分化相关蛋白表达的影响 用灭菌的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。种入HaCaT细胞进行培养， 细胞分组及给药方式同上。用碧云天免疫染色固定液(P0098)固定完毕，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤2次，每次5 min。 加入碧云天免疫染色封闭液(P0102)封闭60 min。 一抗tPA及CD147按照1∶500比例用免疫染色一抗稀释液(P0103)稀释一抗。按照1∶500比例用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧光标记的二抗，室温结合2 h。DAPI染细胞核，直接到荧光显微镜下观察。

1.2.5 消疹止痒喷剂对HaCaT及RAW264.7细胞迁移能力的影响 准备直尺和Marker笔照射紫外线灭菌。将6孔板用封口膜封好倒置于超净台上，用Marker笔沿着6孔板直径平行等距划线用于定位。含10%FBS的DMEM培养液常规培养HaCaT或RAW264.7细胞。取对数生长期细胞、消化细胞，调整细胞密度至2×105·mL-1备用。将上述细胞悬液加入6孔板中，每孔体积2 mL，放入37 ℃、5%CO2培养箱继续培养，观察细胞待其呈融合状态则可进行划痕。按照与预先所定位横线垂直方向，使用一个100 μL无菌枪头进行划痕，枪头摆放要与六孔板垂直，保证划痕的宽度一致。划痕完毕后用枪缓慢吸出培养液，加入适量的PBS将细胞清洗3遍，除去细胞碎片。弃PBS，每孔加入不同浓度的消疹止痒喷剂(0 μL·mL-1、2 μL·mL-1、6 μL·mL-1、10 μL·mL-1)，每个浓度3个复孔，在划痕的不同时间点(0 h，48 h)将6孔板置于倒置显微镜下拍照，观察划痕愈合的程度。

1.2.6 消疹止痒喷剂对HaCaT及RAW264.7细胞侵袭能力的影响 用50 mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。吸出培养板中残余液体，每孔加入50 μl含10 g/LBSA的无血清培养液，37 ℃ 30 min,使基质胶水化再吸去剩余培养液。常规培养HaCaT及RAW264.7细胞，实验前24 h撤血清饥饿。消化细胞用无血清的DMEM培养基重悬浮，调整细胞密度2×106·mL-1。在24孔板中加入DMEM培养基，每孔600 μL。取上述细胞悬液90 μL加入Transwell小室上室中，同时各孔加入浓度分别为20 μL·mL-1、60 μL·mL-1、100 μL·mL-1的消疹止痒喷剂药液，体积10 μL，终浓度2 μL·mL-1、6 μL·mL-1和10 μL·mL-1，对照组加入等体积的DMSO，每个浓度3个复孔。将小室浸于24孔板的培养液中，37 ℃、5% CO2孵箱内孵育6 h，取出小室用镊子轻轻取下滤膜，5%戊二醛4 ℃固定10 min，取出用0.1%结晶紫染液于水平摇床染色30 min，PBS漂洗3次，用棉签擦掉膜上层未穿过的细胞置于载玻片上，200倍镜下观察细胞迁移情况并拍照。200倍镜下随机选取5个视野，计数穿膜细胞数目。

1.2.7 消疹止痒喷剂对RAW264.7细胞基质金属蛋白酶表达的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞用0.25%胰蛋白酶消化制成1×109·mL-1细胞悬液接种于培养皿中，每个培养皿各加入1ml细胞悬液，其余为含10%胎牛血清的DMEM培养液共10 ml体系。细胞分组及给药方式同上，37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后提取蛋白并采用BCA法测定蛋白浓度。变形后取50 μg上样，用10%分离胶、5%浓缩胶电泳，即0.02A每块胶，至溴酚蓝消失，之后转到PVDF膜上。一抗MMP-2 (1∶1000)及MMP-9 (1∶1000)，4 ℃孵育过夜后加1∶10000辣根过氧化物标记的羊抗兔IgG，加入化学发光试剂。用Kodak胶卷曝光，以GAPDH为内参作灰度分析，实验重复3次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 消疹止痒喷剂对LO2细胞增殖的影响

MTT法检测后统计结果显示，消疹止痒喷剂作用24 h可以剂量依赖性地抑制LO2细胞的增殖，IC50值为10.95 μL·mL-1(结果见图1A)。为排除消疹止痒喷剂对正常细胞毒性的作用，我们初步选用2 μL·mL-1、6 μL·mL-1和10 μL·mL-1下消疹止痒喷剂进一步开展后续研究。同时，显微镜下观察浓度为2 μL·mL-1、 6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止痒喷剂对正常肝细胞LO2形态学的影响。图1B显示，2 μL·mL-1、6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止痒喷剂对正常肝细胞LO2的细胞形态无明显改变。为进一步确证2 μL·mL-1、 6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止痒喷剂对LO2的细胞毒作用，选用LDH释放实验证实与空白对照组比较，在此3浓度下的消疹止痒喷剂无诱导LO2细胞LDH释放增加(图1C)。

图1 消疹止痒喷剂对正常肺细胞LO2生长及形态的无明显影响注：A. LO2细胞用消疹止痒喷剂干预24 h后测定其对LO2细胞的增殖抑制率；B. 不同浓度消疹止痒喷剂对LO2细胞形态学的作用(标尺100 μm)；C. 不同浓度消疹止痒喷剂对LO2细胞LDH释放的影响

2.2 消疹止痒喷剂促进角质细胞HaCaT增殖

观察不同浓度消疹止痒喷剂在不同时间点对HaCaT增殖的影响发现，2 μL·mL-1消疹止痒喷剂作用24 h对HaCaT细胞的细胞数目无明显促进效应。但作用48 h及72 h h后，消疹止痒喷剂对HaCaT细胞数目有显著促进作用。6 μL·mL-1和10 μL·mL-1的消疹止痒喷剂在24、 48 h及72 h培养条件下，能明显诱导角质细胞HaCaT的增殖(图2A)。PI3K-AKT信号通路作为细胞内重要信号传导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态, 在细胞内发挥抑制凋亡、促进增殖的关键作用。为初步探究消疹止痒喷剂对HaCaT的增殖核心信号通路的影响，采用免疫印迹法考察PI3K和AKT蛋白的表达情况。实验发现，各组GAPDH的条带亮度相近，而PI3K和AKT在消疹止痒喷剂处理细胞后，与对照组比较处理组亮度有明显差异，可见有明显的增强(图2B)。

2.3 消疹止痒喷剂诱导HaCaT细胞分化

观察不同浓度消疹止痒喷剂对HaCaT分化蛋白表达的影响，免疫印迹实验发现2 μL·mL-1消疹止痒喷剂对HaCaT细胞分化调控蛋白tPA及CD147无明显抑制作用。但6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止痒喷剂对HaCaT细胞分化调控蛋白tPA及CD147的表达有显著抑制作用(图3A)。CD147分子是一种新的低分化角质形成的细胞标志蛋白,可能抑制正常角质形成细胞和鳞状细胞癌细胞的分化。运用细胞免疫荧光实验进一步证实，6 μL·mL-1消疹止痒喷剂能显著抑制HaCaT细胞CD147的表达(图3B)。

2.4 消疹止痒喷剂抑制HaCaT细胞迁移侵袭

图2 不同浓度消疹止痒喷剂对HaCaT细胞增殖的影响注：A. 2 μL/ml消疹止痒喷剂能轻微促进HcCaT细胞的增殖，10 μL/ml消疹止痒喷剂能明显诱导HcCaT细胞的增殖；B. 考察消疹止痒喷剂对HcCaT细胞增殖核心蛋白PI3K及AKT蛋白表达有促进作用

图3 不同浓度消疹止痒喷剂对HaCaT细胞分化指标蛋白的作用注：A. 免疫印迹法考察消疹止痒喷剂对HaCaT细胞分化相关蛋白tPA及CD147表达的影响(GAPDH为内参蛋白)；B. 免疫荧光实验考察消疹止痒喷剂对HaCaT细胞分化指示蛋白tPA及CD147表达的作用(标尺50 μm)

图4 消疹止痒喷剂对HaCaT细胞侵袭数目的影响注：A. 划痕实验考察消疹止痒喷剂对HaCaT细胞在体外迁移能力的影响(标尺100 μm)；B. 侵袭实验测定消疹止痒喷剂对HaCaT细胞侵袭能力的抑制作用(标尺100 μm)

图5 消疹止痒喷剂对RAW264.7细胞侵袭数目的影响注：A. 划痕实验考察消疹止痒喷剂对RAW264.7细胞在体外迁移能力的影响(标尺100 μm)；B. 侵袭实验测定消疹止痒喷剂对RAW264.7细胞侵袭能力的抑制作用(标尺100 μm)

图6 消疹止痒喷剂对RAW264.7细胞MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA表达的影响注：A. 免疫印迹法评价消疹止痒喷剂对RAW264.7细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达的抑制作用；B. Realtime PCR实验测定消疹止痒喷剂对RAW264.7细胞MMP-2和MMP-9 mRNA水平的抑制作用

观察不同浓度消疹止痒喷剂作用于不同时间点对HaCaT细胞迁移的影响发现，随着消疹止痒喷剂浓度的提高，细胞划痕的愈合程度呈递减趋势，结果以0 h和48 h 2个时间点为例，呈现空白对照组和消疹止痒喷剂作用不同时间点HaCaT细胞的划痕愈合情况，并在0 h和48 h测量每组HaCaT细胞显微镜图像中空白间距测量间距(单位为CM)。如图4A显示，在消疹止痒喷剂0 μL·mL-1组0 h空白处研究发现，48 h时对照组划痕区域的HaCaT细胞发生明显迁移，而随着消疹止痒喷剂浓度的增加，划痕区域细胞愈合程度呈降低趋势。观察不同浓度消疹止痒喷剂对HaCaT细胞Transwell小室侵袭能力的影响发现，随着消疹止痒喷剂浓度的提高，细胞侵袭能力呈递减趋势。图4B显示，100×显微镜观察HaCaT细胞侵袭情况，对照组细胞侵袭数目较多，消疹止痒喷剂各浓度组处理24 h后，细胞侵袭数目与对照组比较呈降低趋势，200×显微镜下随机选取5个视野来计数细胞侵袭的数目，发现与对照组比较，2 μL·mL-1消疹止痒喷剂可以抑制MDA-M-231细胞侵袭(P<0.05)， 6 μL·mL-1和10 μL·mL-1消疹止痒喷剂可以显著抑制MDA-MB-231细胞侵袭(P<0.01)。

2.5 消疹止痒喷剂抑制RAW264.7细胞迁移及侵袭

观察不同浓度消疹止痒喷剂作用于不同时间点，对RAW264.7细胞迁移的影响发现，随着消疹止痒喷剂浓度的提高，巨噬细胞RAW264.7细胞划痕的愈合程度呈递减趋势。图5A显示，在划痕后48 h时，对照组划痕区域的RAW264.7细胞发生明显迁移，而随着消疹止痒喷剂浓度的增加，划痕区域RAW264.7细胞的愈合程度呈降低趋势。与迁移结果一致，消疹止痒喷剂对细胞的影响发现，随着消疹止痒喷剂浓度的提高，RAW264.7细胞穿过Transwell小室的侵袭能力呈递减趋势。图5B显示，对照组细胞侵袭数目较多，消疹止痒喷剂在2 μL·mL-1时可以抑制RAW264.7细胞的侵袭(P<0.05)，在6 μL·mL-1和10 μL·mL-1时可以显著抑制RAW264.7细胞侵袭(P<0.01)。

2.6 消疹止痒喷剂对RAW264.7细胞MMP-2/9蛋白表达及转录水平的影响

图6A显示，Western blotting结果显示，消疹止痒喷剂作用24 h后可以在一定程度上剂量依赖性地抑制RAW264.7细胞中MMP-2/9的蛋白表达。与对照组比较，消疹止痒喷剂显著抑制MMP-2、MMP-9 的mRNA表达。Realtime PCR的结果采用ddCT法进行计算后，图6B显示RAW264.7细胞培养24 h后，MMP-2、MMP-9在消疹止痒喷剂2 μL·mL-1时较对照组(消疹止痒喷剂0 μL·mL-1)的表达量有较弱降低，约为对照组表达量的3/4；MMP-2、MMP-9在消疹止痒喷剂6 μL·mL-1时，较对照组(消疹止痒喷剂0 μL·mL-1)其表达量显著降低，约为对照组表达量的1/2；MMP-2、MMP-9在消疹止痒喷剂10 μL·mL-1时，较对照组其表达量显著降低，约为对照组表达量的1/4。

3 讨论

3.1 众所周知，肿瘤已成为人类健康的最大杀手，人类一直不遗余力地寻找治疗肿瘤的最佳方法。随着肿瘤分子生物学研究的进展，对靶向药物的研究逐渐成为肿瘤治疗领域的主要突破点，受到医学界的普遍重视。越来越多的抗肿瘤分子靶向药物被应用于临床而发挥良好的疗效，在众多的靶向药物当中，表皮生长因子受体抑制剂(EGFRI)目前应用最为广泛[9]。EGFRIs已经证明，可改善非小细胞肺癌、胰腺癌、大肠癌患者的总生存期，靶向药物耐受性好，通常出现轻微或中度的毒副反应。尽管大多数不良反应是可以得到迅速处理的，但是严重甚至危及生命的不良反应仍能够发生，其中最常见的是皮肤不良反应[10]。通过皮肤活检的方法，研究吉非替尼治疗前和治疗过程中的皮肤变化，发现治疗前和治疗中表皮厚度比较差异无统计学意义，但治疗后颗粒层变薄且部分中断。另外，治疗后患者的嗜酸性粒细胞角质层变薄，伴有散在的角化不全灶，且该层正常的网纹型特征消失。研究者还在某些标本中发现，苔藓样组织反应发生在毛囊和毛囊间的皮肤，中性粒细胞毛囊炎、角蛋白栓以及漏斗扩大微生物沉积也有报告[11]。组织活检发现，真皮浅层周围的混合性炎症浸润(特别是滤泡周围)、滤泡破裂以及表皮皮肤棘层松解。显微镜下观察痤疮样皮疹病灶发现，有中性粒细胞浸润的毛囊炎和毛囊周围炎，其他研究亦获同样的结论。同时发现角质细胞增殖标志物PI3K和AKT表达显著减少。角质细胞是EGFRI介导皮肤毒性的作用靶点，实验研究表明，EGFRI对皮肤黑色素细胞和成纤维细胞均无作用，而EGFRI作用于增殖的未分化角质细胞，促进终末分化标记如tPA、CD147的表达[12]。

为尽量排除和减少药物导致细胞凋亡和增殖抑制作用对实验结果的影响，选用浓度范围在(2 μL·mL-1～10 μL·mL-1)的消疹止痒喷剂作为研究对象，主要的目的是观察其对角质细胞的增殖、分化及迁移侵袭能力的影响。本研究通过MTT试验发现，消疹止痒喷剂可以剂量依赖性地促进角质细胞的生长数目。通过划痕愈合试验和Transwell小室侵袭试验发现，消疹止痒喷剂可以抑制角质细胞运动迁移以及侵袭能力，通过Western blot技术观测消疹止痒喷剂对角质细胞增殖分化相关因子的蛋白表达水平。实验结果表明，角质细胞中的PI3K和AKT在加入不同浓度的消疹止痒喷剂处理后，其蛋白表达显著上调，同时消疹止痒喷剂可以抑制角质细胞中分化调控蛋白tPA及CD147的表达。

有研究证实，EGFRI通过增加在基底层的细胞周期依赖性激酶抑制剂P27、角蛋白-1、信号转换和转录激活因子3的表达，引起基底角质细胞生长停滞和过早成熟分化，同时伴有炎性巨噬细胞的浸润。为进一步探究消疹止痒喷剂在体外是否能抑制巨噬细胞RAW264.7细胞迁移侵袭过程，以及是否是通过降低MMP-2/9的表达进而抑制迁移侵袭，分别采用划痕愈合实验、Tranwell侵袭实验及免疫印迹实验开展相关研究。结果发现，消疹止痒喷剂能抑制RAW264.7细胞MMP-2/9蛋白的表达，同时对MMP-2/9的mRNA水平表达亦有显著降低效应。但需要注意的是，本实验所涉及的细胞模型均采用的是正常状态下的细胞，为进一步真实还原病理状态下的细胞模型，本课题组考虑今后选用被EGFRI类药物刺激状态下的角质细胞和巨噬细胞作为细胞模型。此外，EGFRI类药物是针对EGFR基因突变研究出的分子靶向药物，我们通过对相关基因的敲除建立裸鼠模型，比较研究“消疹止痒喷剂”对EGFRI相关性皮疹的作用机制。

3.2 随着EGFRI类药物的广泛应用，其不良反应问题愈加突出，尤以皮疹发生率最高，对EGFRI相关性皮疹的治疗也迫在眉睫。目前最常用的方法包括局部使用抗生素、类固醇激素或口服抗生素、免疫调节剂等。但由于抗生素存在耐药性、类固醇激素易诱发溃疡病等弊端，其临床应用受到极大限制[13]。众多研究者更有兴趣从中医药中寻找安全、有效的药物，以改善治疗EGFRI相关性皮疹[14]。“消疹止痒喷剂”为我院自制外用中药制剂，含紫草、野菊花等5味中药，多年的临床试验证实该制剂可有效治疗EGFRI相关性皮疹，且未见明显不良反应。本文通过研究该制剂对角质细胞和炎性巨噬细胞的作用，从微观角度阐明该制剂治疗EGFRI相关性皮疹的作用机理。目前，在靶向药物相关皮疹的预防和治疗方面，中西医尚无统一的治疗标准。本课题组前期对消疹止痒喷剂进行了动物实验和临床试验，结合本次细胞实验，系统地研究了该制剂对此类药疹的药理作用及机制，显示了中医药在治疗靶向药物相关皮疹方面具有的独特优势，值得临床推广使用并深入分析。此外，中西药治疗各有优缺点，对西药治疗引起的副作用辅以中药治疗，也为中西医如何有机结合实现高效低毒提供了参考。

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❋基金项目：国家自然科学基金资助项目(81460759)-蒙药十三味红花密诀丸治疗过敏性鼻炎的实验机制研究

Study on the Cytological Mechanism of the Treatment of EGFRI Associated Eruption with Xiao Zhen and Antipruritic Spray

CHENG Zong-qi1,2,CHEN Lin2, YAO Xin2, JIN Yi2
(1.NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023，China; 2.FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215006，China)

Objective: To explore the effect of Xiaozhen Zhiyang Spray on keratinocyte proliferation and differentiation and the effect on macrophage infiltration.Methods:MTT method was used to observe the different concentrations of Xiaozhen Zhiyang spray on skin keratinocytes HaCaT growth effect; Wound healing and Transwell experiment was used to examine the effect of Xiaozhen Zhiyang Spray on HaCaT and macrophage RAW264.7 exercise ability; Western blotting experiment was used to investigate the effect of Xiaozhen Zhiyang Spray on the proteinic expression of PI3K, AKT, tPA and CD147 in HaCaT cells and MMP-2, MMP-9 in RAW264.7 cells. RT-PCR was used to investigate the effects of Xiaozhen Zhiyang spray on MMP-2 and MMP-9 mRNA levels in RAW264.7 cells. Results: Xiaozhen Zhiyang Spray can dose dependently promote the proliferation of HaCaT cells and inhibit its differentiation.In wound healing and transwell experiment, the migration number and invasive ability of HaCaT and macrophage RAW264.7 decreased with Xiaozhen Zhiyang Spray concentration increased. Xiaozhen Zhiyang Spray can also dose dependently inhibit the expression of proliferation protein PI3K and AKT, and decrease the expression of differentiation protein tPA and CD147. In addition, Xiaozhen Zhiyang spray can significantly inhibit the mRNA and protein expression of MMP2 and MMP9 in RAW264.7. Conclusion: Xiaozhen Zhiyang spray can promote keratinocyte proliferation and reduce the infiltration of macrophage,which is one of the important mechanisms for the treatment of EGFRI associated skin rashes.

Xiaozhen Zhiyang Spray; HaCaT; RAW264.7; Proliferation and differentiation; Migration and invasion

2015年度江苏省中医药科技项目(YB2015175)-基于EGFR信号通路研究“消疹止痒喷剂”对EGFRI相关性皮疹的作用机制；苏州市2014年度科技发展计划(SYSD2014144)-消疹止痒喷剂治疗肿瘤患者靶向药物治疗相关性皮疹的临床疗效及其机制研究

程宗琦，男，主任药师，从事中药药剂学与药事管理研究。

R751

B

1006-3250(2017)08-1078-07

2017-02-18