水通道蛋白4在肺癌裸小鼠模型中的表达及其对肿瘤细胞增殖与迁移的影响研究

周永春，张 琦，陈琬玲，方 育，李融林，张 璟

·论著·

水通道蛋白4在肺癌裸小鼠模型中的表达及其对肿瘤细胞增殖与迁移的影响研究

周永春1，张 琦2，陈琬玲3，方 育4，李融林2，张 璟2

目的探讨水通道蛋白4(AQP4)在肺癌裸小鼠模型中的表达及其对肿瘤细胞增殖与迁移的影响。方法2016年12月于昆明医科大学第三附属医院云南省肺癌重点实验室进行实验，选取SPF级雄性裸小鼠60只并采用随机数字法分为对照组与观察组，每组30只。对照组裸小鼠于背侧靠腋窝处皮下注射未转染的A549肺癌细胞0.2 ml以建立肺癌裸小鼠模型，而观察组裸小鼠于背侧靠腋窝处皮下注射AQP4-shRNA转染的A549肺癌细胞0.2 ml以建立肺癌裸小鼠模型。比较两组裸小鼠肿瘤重量、微血管密度(MVD)，AQP4、E-钙黏着蛋白(E-cadherin)、N-钙黏着蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达水平。结果观察组裸小鼠肿瘤重量及MVD低于对照组(P<0.05)。观察组裸小鼠AQP4、N-cadherin、Vimentin表达水平低于对照组，E-cadherin表达水平高于对照组(P<0.05)。结论APQ4在肺癌裸小鼠模型中表达增强，其可能参与了肺癌的病理生理过程，可在一定程度上促进肿瘤细胞的增殖与迁移。

肺肿瘤；小鼠，裸；水通道蛋白质4

近年来，随着工业的发展、空气污染加重及人们生活习惯的改变，肺癌的发病率呈逐年上升趋势。目前，临床诊疗技术不断提高，使肺癌的早期诊断和治疗方法改进，但肺癌患者的5年生存率未改善[1]。水通道蛋白(AQPs)是近年发现的一组与水通道有关的细胞膜转运蛋白，其在细胞膜上组成孔道，可影响水跨膜转运和细胞内外环境平衡[2]；其种类较多，且分布于不同的组织中，在多种生理活动中发挥着重要作用[3]。研究表明，AQPs在肿瘤细胞增殖、迁移、扩散及侵袭过程中表达增强[4]。本研究旨在探讨水通道蛋白4(AQP4)在肺癌裸小鼠模型中的表达及其对肿瘤细胞增殖与迁移的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性的裸小鼠60只，体质量15～22 g，月龄4～6个月，由北京维通利华实验动物有限责任公司提供，动物编号：SCXK(沪)2015-0002；饲养于昆明医科大学第一附属医院动物中心实验室SPF环境中，温度(24±2)℃，湿度60%～70%。实验时对实验动物的处理方式符合动物伦理要求。

1.1.2 实验试剂 免疫组化化学试剂盒和酶底物购自北京中杉生物科技有限公司；山羊抗兔一抗和二抗购自赛默飞公司；预染液Marker购自美国New England Biolab公司，Ecl发光液购自美国皮尔斯公司；台盼蓝染液购自上海科兴生物有限公司；碘伏购自上海翔升实业有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；苏木精购自美国Sigma-Aldrich；AQP4抗体购自英国Abcam公司；3′3二氨基联苯胺购自郑州阿尔法化工有限公司；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.3 实验设备与仪器 2123型孵育箱(美国Shellab)；TGL-16G型台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；XS-212-201型光学显微镜(南京光电集团股份有限公司)；XDS-1B型倒置显微镜(重庆光电集团股份有限公司)；WD800型微波炉(广东格兰仕公司)；HS-ES 500型生物组织石蜡包埋机(金华市华速科技有限公司)；A1004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；研磨器(巩义市颖辉高铝瓷厂)；6孔细胞培养板(上海晶安生物科技有限公司)；RM2145石蜡标本切片机(德国LEICA公司)；SW-CJ-1F型超净工作台(苏州净化设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组方法 2016年12月于昆明医科大学第三附属医院云南省肺癌重点实验室进行实验，对裸小鼠进行编号并采用随机数字表法分为观察组与对照组，每组30只。观察组裸小鼠体质量16～21 g，平均体质量(17.3±4.6)g；对照组裸小鼠体质量15～22 g，平均体质量(18.1±3.5)g。两组裸小鼠体质量比较，差异无统计学意义(t=0.758，P>0.05)。

1.2.2 模型制备方法 (1)采用10%小牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素、10%非必需氨基酸的RPMI1640培养基，于37 ℃，5%的CO2孵育箱中进行肺癌细胞培养，定期换液，3～5 d传代一次，培养18 h将细胞进行消化、离心和重悬后稀释为1×106个/L，以2 ml/孔接种于6孔培养板中。(2)以AQP4-shRNA转染A549肺癌细胞，采用0.4%台盼蓝染色标记活细胞数，裸小鼠背侧靠腋窝处经碘伏消毒，观察组裸小鼠皮下注射AQP4-shRNA转染A549肺癌细胞0.2 ml(细胞密度：3×107/ml)，对照组裸小鼠皮下注射未转染的A549肺癌细胞0.2 ml。(3)接种后7～10 d，裸小鼠接种部位出现硬结节状组织，以确定建模成功。

1.2.3 标本采集 于造模成功后以离断颈椎法处死两组裸小鼠，摘取肿瘤组织，称重并记录；肿瘤组织经4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，切片(4 μm)，苏木素染色，常规脱水，透片，封片。

1.2.4 观察指标 (1)肿瘤重量、微血管密度(MVD)：采用A1004N电子天平称量两组裸小鼠肿瘤重量；采用CD34标记，于100倍低倍镜下全面观察切片以确定血管高密度区域；在200倍视野下观察与周围肿瘤细胞和结缔组织成分明显区别的任何一个棕色染色的细胞簇作为一个微血管，只要结构不相连，其分支结构也可作为一个微血管进行计数，记录8个视野内的微血管数，取平均值。(2)AQP4、E-钙黏着蛋白(E-cadherin)、N-钙黏着蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达水平：两组裸小鼠标本予以3%过氧化氢孵育消除过氧化物酶活性，微波修复10 min，滴加非免疫性血清，室温孵育20 min后去除血清；滴加AQP4抗体，过夜后利用磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱后进行染色，利用3′3二氨基联苯胺进行显色反应；采用苏木精复染，封片后观察颜色变化(棕黄色为阳性)；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的检测方法同AQP4(AQPs抗体分别更换为E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗体)。

2 结果

2.1 肿瘤重量、MVD观察组裸小鼠肿瘤重量为(0.41±0.18)g，对照组裸小鼠肿瘤重量为(1.02±0.23)g。观察组裸小鼠肿瘤重量低于对照组，差异有统计学意义(t=2.98，P<0.05)。观察组裸小鼠MVD为(20.1±9.2)条；对照组裸小鼠MVD为(45.2±12.3)条。观察组裸小鼠MVD低于对照组，差异有统计学意义(t=3.38，P<0.05)。两组裸小鼠肿瘤细胞质量形态见图1。

图1 两组裸小鼠肿瘤质量

2.2AQP4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达水平 光学显微镜下可见裸小鼠肿瘤组织中AQP4、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达(见图2)；观察组裸小鼠AQP4、N-cadherin、Vimentin表达水平低于对照组，E-cadherin表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table1 Comparison of expressions of AQP4，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin of nude mice between the two groups

组别例数AQP4E-cadherinN-cadherinVimentin对照组300.27±0.030.31±0.020.41±0.040.34±0.03观察组300.23±0.020.36±0.030.34±0.030.28±0.02t值6.0767.5967.6689.115P值<0.05<0.05<0.05<0.05

注：AQP4=水通道蛋白4，E-cadherin=E-钙黏着蛋白，N-cadherin=N-钙黏着蛋白，Vimentin=波形蛋白

注：AQP4=水通道蛋白4，E-cadherin=E-钙黏着蛋白，N-cadherin=N-钙黏着蛋白，Vimentin=波形蛋白

图2 两组裸小鼠AQP4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达情况(HE染色，×100)

Figure2 Expressions of AQP4，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin of nude mice of the two groups

3 讨论

肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，其发病率居男性恶性肿瘤之首，严重威胁人们生命健康。外科手术是目前治疗早期肺癌的主要手段，但患者生存率较低；另外，放化疗治疗晚期肺癌患者的毒副作用较多，且治疗效果欠佳。因此，肺癌的治疗仍是临床亟待解决的难题之一。近年来，随着肺癌靶向治疗的发展，许多靶点相继发现给肺癌患者带来了福音。

AQPs是一组小分子疏水性的内在膜蛋白家族，存在于动物、植物和微生物的细胞膜上，目前已发现超过20种亚型，各种亚型均有相似的蛋白结构和高度同源的DNA序列，均具有促进血管增生和增加血管渗透性的作用[4-5]。APQ4由2个重复跨膜域构成，有2个连接环，且每个链接环包含1个天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸特征性序列，当2个链接环发生重叠并形成1个孔道时可使1个水分子实现跨膜转运[6-8]。研究表明，APQ4具备水分子转运功能，可增强细胞膜水渗透性，促使肿瘤细胞迁移[9]；其敲除可明显降低星形胶质细胞迁移能力[10]；并在肿瘤细胞生长和血管生成、侵袭及转移中发挥着重要作用[11-12]。

本研究结果显示，观察组裸小鼠肿瘤重量、MVD低于对照组，与相关研究结果一致[13]，提示APQ4可促进肿瘤细胞增殖和血管生成。研究表明，APQ4可增加肿瘤细胞的扩散能力，N-cadherin和Vimentin有助于提高细胞生长速度和转移能力，尤其在侵袭性肿瘤中；E-cadherin可保持上皮细胞的正常功能和完整性，抑制肿瘤细胞的转移和扩散[14]；APQ4在肺癌中的表达水平较高，可促进肿瘤细胞生长和迁移[15]。本研究结果显示，观察组裸小鼠AQP4、N-cadherin、Vimentin表达水平低于对照组，E-cadherin表达水平高于对照组，与相关研究结果一致[14]。分析原因可能为本研究观察组通过抑制APQ4的表达而导致N-cadherin和Vimentin的表达水平降低和E-cadherin表达水平升高，而减缓了肿瘤细胞生长速度。

综上所述，APQ4在肺癌裸小鼠模型中表达增强，其可能参与了肺癌的病理生理过程，可在一定程度上促进肿瘤细胞增殖与迁移。但本研究未探讨APQ4在肺癌迁移中的具体作用机制，仍有待进一步研究完善。

作者贡献：周永春、张琦、陈婉玲进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；方育、李融林、张璟进行实验实施、评估、资料收集；周永春进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：李洁晨)

ExpressionandImpactonTumorCellProliferationandMigrationofAQP4inNudeMicewithLungCancer

ZHOUYong-chun1，ZHANGQi2，CHENWan-ling3，FANGYu4，LIRong-lin2，ZHANGJing2

1.YunnanProvincialKeyLaboratoryforLungCancer，theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650118，China2.DepartmentofThoracicSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650031，China3.DepartmentofOncology，YunnanProvincialGeneralHospitalofChineseArmedPoliceForce，Kunming650221，China4.DepartmentofAnesthesiology，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650031，China

ObjectiveTo investigate the expression and impact on tumor cell proliferation and migration of AQP4 in nude mice with lung cancer.MethodsThis experiment was carried out in December 2016，in Yunnan Provincial Key Laboratory for Lung Cancer，the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University.A total of 60 SPF-level male nude mice were selected and divided into control group and observation group according to random number table，each of 30 mice.Nude mice of control group

subcutaneous injection of A549 lung cancer cells without infection(0.2 ml)around dorsal axillary tissue to prepare the lung cancer model，while nude mice of observation group received subcutaneous injection of A549 lung cancer cells with AQP4-shRNA infection(0.2 ml)around dorsal axillary tissue to prepare the lung cancer model.Tumor weight，microvessel density，expressions of AQP4，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin were compared between the two groups.ResultsTumor weight and microvessel density of observation group were statistically significantly lower than those of control group(P<0.05).Expressions of AQP4，N-cadherin and Vimentin of observation group were statistically significantly lower than those of control group，while expression of E-cadherin of observation group was statistically significantly higher than that of control group(P<0.05).ConclusionExpression of APQ4 is higher in nude mice with lung cancer，it may plan a role in the pathophysiological process of lung cancer，can promote the tumor cell proliferation and migration to some extent.

Lung neoplasms；Mice，nude；Aquaporin 4

云南省教育厅科研基金重点项目(2013Z110)；云南省科技厅-昆明医科大学联合专项基金项(2013FB132)；云南省卫生科技计划项目(2014NS001)；云南省应用基础研究面上项目(2016FB145)

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.08.016

2017-03-10；

2017-08-05)

1.650118云南省昆明市，昆明医科大学第三附属医院云南省肺癌重点实验室

2.650031云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院胸外科

3.650221云南省昆明市，中国人民武装警察部队云南省总队医院肿瘤科

4.650031云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院麻醉科

周永春，张琦，陈琬玲，等.水通道蛋白4在肺癌裸小鼠模型中的表达及其对肿瘤细胞增殖与迁移的影响研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2017，25(8)：69-72.[www.syxnf.net]

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