河南新乡宠物犬、猫与弓形虫病感染关系探讨

党耀宏，王苏康，方鹏超，张萌，张永乐，苗硕，胡翠，张露文，刘世国＊

（1新乡医学院第一临床学院河南新乡453000；2新乡医学院分子病原体实验室河南新乡453000）

河南新乡宠物犬、猫与弓形虫病感染关系探讨

党耀宏1，王苏康1，方鹏超1，张萌1，张永乐1，苗硕1，胡翠1，张露文2，刘世国2＊

（1新乡医学院第一临床学院河南新乡453000；2新乡医学院分子病原体实验室河南新乡453000）

目的：为了了解河南省新乡市宠物犬、猫弓形虫感染情况，探讨兽龄、性别与弓形虫感染关系，为弓形虫病的防治提供依据。方法：2014年10月-2015年10月直接采集动物静脉血，用酚试剂方法提取宠物犬、猫血液中总DNA，将弓形虫529多拷贝片段作为待检弓形虫序列，通过单管一步法巢式PCR技术随机对新乡市区124只宠物犬、54只宠物猫进行了弓形虫检测。结果：124份宠物犬样本中，弓形虫阳性13份，阳性率为10.48%（13/124），54份猫样本中有弓形虫阳性28份，阳性率为51.85%（28/54）；猫血样本中，雌性阳性率63.16%（12/19），雄性阳性率47.83%（11/23）；猫各年龄段中，小于6月龄阳性率66.67%（6/9），6月～12月龄阳性率75.00%（6/8），1岁～3岁阳性率60.00%（9/15），3岁以上阳性率50.00%(1/2)。结论：宠物猫弓形虫感染率高于宠物犬；宠物猫性别之间弓形虫感染无显著差异；随着年龄增长，宠物猫弓形虫感染率逐渐下降。

弓形虫；犬；猫；巢式PCR

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种世界范围内分布的细胞内寄生虫，能感染几乎所有的温血动物，包括人类、家畜和野生动物。人畜和禽类等其他动物为中间宿主，猫及猫科类动物是它的终末宿主。人类通过消费未煮熟的肉类（含有组织囊肿或孢子化卵囊）而感染，可以导致胎儿和免疫低下的人群患病，甚至威胁他们的生命。狗和猫是世界上最受欢迎的宠物动物，如今，狗已经承担了许多功能：作盲人向导，作为警卫和猎狗，有一个宠物的好处是不可争议的，猫和狗都成了人类家庭的一部分。但动物和人弓形虫感染都呈上升趋势，因此，准确把握宠物弓形虫感染状况，对弓形虫病的防治尤为重要。

目前弓形虫的常用检测方法主要有血清学、病原形态鉴定和小鼠腹腔接种及核酸检测等。血清学检测阳性率较高，但常存在假阳性及既往感染的缺点；小鼠接种检测周期较长，临床上难以推广；PCR检测待检样品中虫体核酸的方法是近年来常用的检测手段，以检测到病原体目的DNA为阳性标准，此法可以快速、敏感、特异地检测到弓形虫感染。为了解河南省新乡市宠物犬、猫弓形虫感染情况，本研究于2014年10月-2015年10月运用PCR检测技术开展了宠物犬、猫弓形虫感染的流行病学调查。

1 材料与方法

1.1 试剂

蛋白酶K（USA Genview），Tris饱和酚（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），PCR 2*Es Taq master mix（中国北京康为世纪生物科技有限公司），弓形虫RH株由新乡医学院人体寄生虫学教研室长期保种，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 样品采集及预处理

2014年10月-2015年10月在新乡市各地区随机采集宠物犬124份血样，每只动物采集3～4 mL静脉血，4℃存放备检。随机收集宠物猫血样54份，其中雌性19份，雄性23份，12份性别不明；体重1.5～7.5 kg；年龄小于6个月9份，6～12个月8份，1～3岁5份，3岁以上2份，20份年龄不详。每只采取1.5～2 mL静脉血EDTA抗凝，4℃存放备检；健康犬、猫血400μL，由新乡医学院人体寄生虫学教研室提供，同法处理备用。

1.3 方法

宠物犬、猫血DNA的提取按酚-氯仿苯酚抽提法进行，弓形虫RH株滋养体的DNA提取常规采用酚-氯仿法进行。以宠物犬、猫血总DNA为模板，进行单管一步法巢式PCR，扩增弓形虫529多拷贝片段。弓形虫529外引物F：5'-CGC TGC AGG GAG GAA GAC GAA AGTTG-3'，R：5'-CGC TGC AGA CAC AGT GCA TCT GGA TT-3'，弓形虫529内引物F：5'-AGA AGG GAC AGA AGT CGA AG一3', R：5'一CTC CAC TCT TCA ATT CTC TCC一3'。PCR反应条件为：95℃2 min，95℃30 s，68℃30 s，72℃50 s进行15循环扩增；然后在95℃30 s，58℃30 S，72℃50 s，72℃5 min条件下再进行共35循环扩增，每个样本DNA扩增反应均在一个PCR反应管内进行。取15μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。以RH株弓形虫滋养体DNA作阳性对照，ddH2O作空白对照。PCR反应结果见图一。

图1 弓形虫529多拷贝片段的扩增

1.4 数据处理

EXCEL 2010建立数据库，SPSS 19.0进行统计分析。不同种类阳性率之间的比较用x2检验，P＜0. 05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 犬、猫弓形虫感染情况

犬弓形虫阳性率为10.48%，猫弓形虫阳性率为51.85%，经统计学分析，X2=36.313，P＜0.005，新乡市宠物猫与宠物犬感染率有显著差异。（见表1）

2.2 各年龄段猫弓形虫感染情况

小于6月龄猫感染率为66.67%，6月～12月龄猫感染率为 75.00%，1岁 ～3岁猫感染率为60.00%，3岁以上的猫感染率为50.00%，未知年龄的猫感染率为30.00%。在猫各年龄段中差异不显著。（见表2）

2.3 不同性别猫弓形虫感染情况

雌猫感染率为 63.16%，雄性猫感染率为47.83%，未知性别的猫的感染率为41.67%，性别差异不显著。（见表3）

表1 犬、猫弓形虫感染情况

表2 猫各年龄段弓形虫感染情况

表3 不同性别猫弓形虫感染情况

3 讨论

据统计1985-2006年期间，我国犬弓形虫感染率在0.66%～62.3%之间不等，猫弓形虫感染率在14.06%～78%之间[1]。本次对新乡市区的各宠物诊所中124只宠物犬，54只宠物猫进行了实验室检测，宠物犬的阳性率为10.48%，宠物猫的阳性率为51.85%。宠物犬与国内报道的山东阳性率3.50%，海口阳性率2.6%相比较高，与贵阳阳性率19.5%，北京阳性率13.2%相比较低，宠物猫在国内报道结果与宠物狗相似（山东阳性率3.90%，海口阳性率5.58%，贵阳阳性率63.2%，北京阳性率57.8%），这表明新乡市宠物的弓形虫感染处于全国中等水平。而结果与德国报道的牧羊犬阳性率46.3%，流浪猫阳性率47.2%相比，德国犬、猫都处于较高的感染水平，这可能是流浪狗、猫比宠物狗、猫感染更加显著的原因。本次调查结果显示：宠物猫阳性率显著高于宠物狗，这与报道的日本（猫阳性率6.7%，狗阳性率1.9%）、德国（猫阳性率33.6%，狗阳性率9.4%）、中国海南（猫阳性率5.58%，狗阳性率2.6%）结果相符。阳性猫排泄大量的弓形虫卵囊污染人类环境，它在人类感染弓形虫的过程中起到了极大的作用，我们对其的监测与防治不容忽视。

这次调查宠物猫雄性与雌性弓形虫感染率差异无显著性（雄性阳性率47.83%，雌性阳性率63.16%，P＞0.05）。与德国（雄性阳性率47.9%，雌性阳性率52.1%，P＞0.05）、巴基斯坦（雄性阳性率25.68%，雌性阳性率27.27%，P＞0.05）、中国长沙（雄性阳性率27.2%，雌性阳性率28.5%，P＞0.05）等性别差异的调查结果相符合。在不同年龄阶段，有人认为幼年的猫可以从母体中获得，也可以在后天哺乳中获得，并且幼猫免疫系统仍在发育，表现出较高的阳性率，有报道称小于1岁的猫（46.6%）弓形虫感染率显著高于大于1岁的猫（18.4%，P＜0.001），随着年龄的增加感染率也在下降,本次调查结果与上述报道相符。可能与幼猫抵抗力低易感染弓形虫，显性感染而未得到及时治疗，伴发其他疾病死去，存活者感染率较低。

我国人口标准化弓形虫感染率6.02%，国际人口标准化感染率5.52%，随着宠物的品种和数量的急剧增加，人类与动物接触的日益频繁，通过动物将动物源人兽共患病传播给人类的风险日益增大，对疾病传播的防控刻不容缓。我们发现猫和狗的性别、年龄对弓形虫的传播无显著差异，Dubey等人也认为不同年龄、性别和品种的猫对弓形虫都易感。而流浪猫相比宠物猫感染率较高，可能是因为流浪猫的户外访问和狩猎行为较多，并且排出含有弓形虫卵囊的粪便污染环境。狗虽然不能产生卵囊，但因为他们的嗅觉能力，有寻找和滚动恶臭物质并污染毛皮的习惯，可能从猫屎机械传递卵囊给人类。

为了降低弓形虫传播，应尽可能的控制流浪猫，流浪狗的数量；注意宠物猫，宠物狗的卫生和必要的体检；避免食用未煮熟的肉类；孕妇或免疫功能低下的人要避免接触猫、狗及其粪便。■

[1] 郑世英,郑芳,李士平,等.山东省部分地区犬猫弓形虫病流行情况调查[J].中国兽医杂志.2015,51(3)：74-75.

Epidemiological Investigations of Toxoplasmosis in PetDogs and Cats in Xinxiang City ofHenan Province

DANG Yaohong1,WANG Sukang1,FANG Pengchao1,ZHANG Meng1,ZHANG Yongle1,M IAO Shuo1,Hu Cui1,ZHANG Luwen2,LIU Shiguo2＊

(1.FirstAffiliated HospitalofXinxiang MedicalUniversity,Xinxiang,453000; 2.Molecular pathogen laboratory ofXinxiang MedicalUniversity,Xinxiang,453000.)

Objectives：A epidemiological survey of Toxoplasma gondii infection in petdogs and cats in Xinxiang City,Henan Province，to explore the relationship between animal age and gender with Toxoplasmosis,and to provide the basis for the prevention and treatmentof Toxoplasmosis.Methods：Single tube nested PCR was used to detect the DNA fragment sequences of Toxoplasma gondiiwhich is distilled from collecting venous blood of 124 petdogs and 54 petcats by Phenol reagentin Xinxiang area during the period from October 2014 to October 2015.Results：The results showed that the positive rate was 10.48%(13/124)in 124 petdogs and 51.85%(28/54) in pet cats blood samples,in this pet cats blood samples,63.16%(12/19)in the female and 47.83%(11/23)in male.Allages ofcats,the positive rate was 66.67%(6/9)less than 6 months old,75.00%(6/8)from 6 to 12 months old，60.00%(9/15)from 1 yearold to 3 years old and 50.00%(1/2)above 3 years old.Conclusion：The Toxoplasmosis positive rate ofpetcats was significantly higher than petdogs.There was no significantdifferences in Toxoplasma gondiiinfection ofpetcats among sexes.When the age ofpetcatgrows,the infection rate of Toxoplasma gondiiis gradually declined.

Toxoplasma gondii;dog;cat;Nested PCR.

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.06.052

*通讯作者：刘世国，lsg1963@163.com