乳酸菌对苜蓿青贮质量和黄酮含量的影响

姜义宝， 王 洋， 刘振阳， 孙娟娟， 严学兵， 玉 柱

(1. 河南农业大学牧医工程学院， 河南 郑州 450002； 2. 中国农业科学院草原研究所， 内蒙古 呼和浩特 010010； 3. 中国农业大学动物科技学院， 北京 100193)

紫花苜蓿(Medicagosativa.)是一种优质豆科牧草，富含多种营养成分和黄酮等生物活性物质。乳酸菌是重要的青贮添加剂，可辅助发酵并防止腐败。乳酸菌在发酵过程中对植物黄酮含量和组分有较大影响，于国萍[1]报道乳酸菌发酵法水解大豆异黄酮可使游离型大豆异黄酮含量增加，苜蓿青贮饲料发酵过程中以及添加乳酸菌对黄酮的影响还未见报道，本研究旨探讨在不同青贮时间条件下乳酸菌对苜蓿青贮品质和黄酮含量动态变化的影响，为苜蓿青贮技术开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及添加剂

青贮材料苜蓿为河北涿州实验基地种植的‘中牧1号’紫花苜蓿，初花期刈割，乳酸菌为中国农业大学青贮实验室分离出的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，青贮原料化学成分,如表1所示。

1.2 试验设计

苜蓿青贮原料切短至2 cm左右，经过自然晾晒至含水量为50%，添加乳酸菌1×106CFU·g-1作为试验组，3个重复，另设一组对照，不添加任何添加剂，原料装填到青贮瓶中，压实后盖上内外盖，并用胶带密封，密度为650～680 g·L-1，室温条件下放置。

表1 苜蓿青贮原料化学成分Table 1 Chemical composition of Medicago sativa ensilage materials

1.3 试验方法

1.3.1样品处理 青贮第3，5，7，15，30和60 d打开青贮瓶，取 20 g放入到榨汁机中，加入180 mL纯净水，匀浆2 min后过滤。滤液用来测定pH值、氨态氮(ammonia nitrogen，AN)、乳酸(lactic acid，LA) 、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyric acid，BA)。将剩余青贮饲料收集烘干，测定干物质(dry matter，DM)、总氮(total nitrogen，TN)、粗蛋白质(crude protein，CP)，可溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate，WSC)、中性洗涤纤维(neutral detergent fibre，NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fibre，ADF)。

1.3.2发酵品质测定 pH值采用雷磁PHSJ-4F测定，氨态氮采用苯酚-次氯酸钠比色法[2]，计算氨态氮/总氮(ammonia nitrogen/total nitrogen，AN/TN)，水溶性碳水化合物采用蒽酮-硫酸比色法[3]，采用SHIMADZE-10A型高效液相色谱仪测量乳酸、乙酸、丙酸和丁酸。

1.3.3营养成分及黄酮含量的测量 65℃ 烘箱中烘干 48 h，进行干物质含量测量，采用范氏方法(Van Soest)测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量[4]，粗蛋白采用Tecator 1030型全自动凯氏定氮仪测量。按照薄亚光等[5]方法进行，在分光光度计510 nm处测样品的吸光度，计算黄酮总含量。

1.4 数据分析

采用Excel 2007整理数据，SPSS 19.0进行数据统计分析，采用T检验，以P<0.05为差异显著性标准，并对两个变量之间进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 苜蓿青贮过程中pH值、干物质和乳酸含量的变化

由表2可知，在青贮3 d到60 d，添加乳酸菌组干物质含量高于对照组，但差异不显著。两组pH值变化较大，在青贮第3 d没有明显差异，第5 d到60 d乳酸菌组低于对照组且差异显著(P<0.05)。乳酸含量随着青贮时间的延长呈增加趋势，5 d到60 d乳酸菌组显著高于对照组(P<0.05)。

表2 苜蓿青贮过程中pH值、干物质和乳酸含量的变化Table 2 Changes of pH, dry matter and lactic acid contents of alfalfa silage during ensiling

2.2 苜蓿青贮过程中挥发性脂肪酸含量的变化

由表3可知，随着时间的延长，两组乙酸含量均呈现增加趋势，乳酸菌组乙酸含量低于对照组， 7 d到60 d显著低于对照组(P<0.05)。青贮过程中乳酸菌组丙酸含量除了在青贮15 d高于对照组外，其他时间均低于对照组，并在7 d显著低于对照组(P<0.05)。青贮3 d和30 d丁酸含量乳酸菌组均低于对照组。乳酸菌组乳酸/乙酸高于对照组，除3 d外，均差异显著(P<0.05)。

表3 苜蓿青贮过程中挥发性脂肪酸含量的变化Table 3 Changes of volatile fatty acid contents of alfalfa silage during ensiling

2.3 苜蓿青贮过程中氨态氮/总氮及可溶性碳水化合物含量的变化

由表4可知，青贮过程中氨态氮/总氮随着时间的延长而增加，并且乳酸菌组始终低于对照组(P<0.05)。对照组可溶性碳水化合物在青贮过程中随着时间的延长呈下降趋势，乳酸菌组呈先增高后降低变化趋势，乳酸菌组高于对照组，但差异不显著。

表4 苜蓿青贮过程中氨态氮/总氮及可溶性碳水化合物含量的变化Table 4 Changes of ammonia nitrogen/total nitrogen and water-soluble carbohydrate contents of alfalfa silages during ensiling

2.4 苜蓿青贮过程中营养成分和黄酮含量的变化

由表5可知，青贮过程中乳酸菌组与对照组相比粗蛋白含量无明显差异。中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量随着时间的延长呈降低趋势，并且乳酸菌组酸性洗涤纤维在7 d显著低于对照组(P<0.05)。青贮过程中乳酸菌组和对照组黄酮含量随着时间的延长而增加，30 d乳酸菌组黄酮含量高于对照组，并且差异显著(P<0.05)。

表5 苜蓿青贮过程中营养成分和黄酮含量的变化Table 5 Changes of nutrition and flavonoids contents of alfalfa silage during ensiling

2.5 黄酮与乳酸和pH值的回归及相关分析

由表6可知，无论是乳酸菌组还是对照组，苜蓿青贮过程中pH值和乳酸含量对黄酮影响很大，两组中黄酮和pH值呈明显的负相关(P<0.05)，对照组中黄酮与乳酸含量呈显著正相关(P<0.05)。

表6 黄酮与乳酸和pH值的回归分析和相关性分析Table 6 Regression and correlations analysis of flavonoids between lactic acid and pH

3 讨论与结论

3.1 乳酸菌对苜蓿青贮过程中发酵品质的影响

青贮发酵过程伴随着营养物质的改变，试验苜蓿青贮过程中干物质含量均有下降，添加乳酸菌后干物质含量高于对照组，添加乳酸菌5 d青贮饲料pH值4.77、第7 d为4.08，达到优质青贮饲料的要求。试验中对照组乙酸含量在后期显著高于乳酸菌组，乳酸/乙酸含量低于乳酸菌组，表明添加乳酸菌后苜蓿青贮过程中以同型发酵为主时期延长，减少了干物质的损失。丁酸和氨态氮含量是衡量青贮饲料优劣的重要指标[6]。添加乳酸菌后从3 d开始氨态氮/总氮含量显著低于对照组，表明添加乳酸菌使苜蓿原料草附着的乳酸菌数量增加，形成酸性环境，减少早期植物蛋白酶对含氮化合物的降解作用，降低氨态氮/总氮含量，改善青贮饲料的发酵品质。

3.2 乳酸菌对苜蓿青贮过程中营养成分和黄酮含量的影响

青贮过程中无论对照组还是添加乳酸菌，苜蓿青贮饲料中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量随着时间的延长呈现降低的趋势，乳酸菌组中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维低于对照组，可能是由于添加乳酸菌改善了发酵条件，增加青贮中有效乳酸菌数量，大量乳酸菌发酵利用了部分纤维而导致青贮苜蓿中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量降低，试验中乳酸菌组对粗蛋白含量没有明显的影响，这与赖玉娇研究结果相一致[7]。青贮发酵过程中营养成分及物质的变化是一个复杂的化学反应过程，原料所含的各种成分都可能发生变化，黄酮是苜蓿重要的生物活性物质之一，随着青贮时间的延长，黄酮含量呈现升高的变化趋势，添加乳酸菌后苜蓿黄酮含量在整个青贮过程中均高于对照组，并在青贮30 d差异显著，表明添加乳酸菌能够提高苜蓿中黄酮的含量，原因可能是苜蓿中黄酮类化合物大部分与细胞壁中的木质素结合在一起，青贮过程中可以破坏植物细胞壁，使萃取时细胞内的物质更多释放出来。

综上所述，添加乳酸菌改善了苜蓿青贮发酵品质，迅速降低pH值，提高乳酸含量，降低酸性洗涤纤维，增加苜蓿黄酮含量，并且苜蓿青贮过程中黄酮含量与pH值和乳酸呈显著相关性。