利用CRISPR/Cas9 技术创建OsCOL9水稻突变体

刘 维，刘 浩，董双玉，古丰玮，陈志强，王加峰，王 慧

(华南农业大学，国家植物航天育种工程技术研究中心，广东 广州 510642)

利用CRISPR/Cas9 技术创建OsCOL9水稻突变体

刘 维，刘 浩，董双玉，古丰玮，陈志强，王加峰，王 慧

(华南农业大学，国家植物航天育种工程技术研究中心，广东 广州 510642)

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑，为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料，抗病基因OsCOL9为靶基因，探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp，编码一个422 aa蛋白，分子量大小约为45.6 kDa，蛋白质结构的N端含有B-box结构域，C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1 ) 结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点，靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端，分别由 U3、U6a、U6b以及U6c 启动子驱动，提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明，T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp，突变次数最多可达11次，取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应，因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入，加上该技术的快捷、简便，对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。

水稻；基因编辑；CRISPR/Cas9；OsCOL9

水稻(OryzasativaL.)属于禾本科植物，主要种植在亚洲以及非洲的热带和亚热带地区，全球约一半以上的人口以此为主食。由于粮食的高消耗以及地理气候因素的限制，导致世界范围内的粮食危机。要解决该问题，必须要借助科学技术以及合理的粮食种植从根源上提高粮食的产量。水稻遗传背景的多样化是水稻育种可持续性发展的关键，基因编辑技术为此带来了新的发展机遇[1]。基因编辑就是通过对基因组的修饰，从而改变某一特定性状的一种技术，可以在海量的测序数据中挖掘基因型对表现型的影响，广泛应用于生物医学以及植物病理相关领域。水稻不仅是单子叶的模式植物，更是重要的粮食作物，所以利用基因编辑技术准确有效地对水稻基因组进行修饰，对水稻重要性状的改良有着重要的意义。

传统的基因靶向修饰技术依赖于自然条件下细胞内的同源重组 (Homologous recombination，HR)，即减数分裂过程中基因重组以及有丝分裂前DNA双链断裂的修复，但是在动植物细胞内其效率非常低，极大地限制了该技术的应用[2]。人工核酸酶介导的基因编辑技术凭借其高效性、特异性强、周期短迅速成为基因定点编辑研究的热点。如锌指核酸酶 (Zinc-finger nucleases，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)通过引导位点特异性核酸内切酶对特定的靶向序列进行切割产生双链断裂的 (Double strand break，DSB) 缺口。由于细胞内的DNA双链具有自我修复的功能，DSB可以通过非同源末端连接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)以及HR修复途径使基因组DNA缺口处有碱基的插入或者缺失，从而实现基因编辑的目的[3-6]。ZFN和TALEN的DNA结合域改造比较复杂，容易出现脱靶的现象，且这2种技术的核酸内切酶FokⅠ必须在形成二聚体的条件下才能发挥酶切作用，这极大地限制了这2种技术的应用[7]。CRISPR在1987年首次被日本科学家Ishino等[8]在大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现。CRISPR/Cas9系统的应用代表第3代基因编辑技术的产生，该系统具有较好的可操作性、特异性、高效性，仅需要gRNA和核酸酶(Cas9)识别靶基因的PAM(Protospacer adjacent motif)序列就可以进行定点突变[9-10]。目前，CRISPR/Cas9 技术在基因治疗以及动植物新品种的改造和培育中都得到了较好的应用，如在作物中对水稻、小麦、玉米、高粱都实现了基因组的定点编辑[11-13]。研究表明，CRISPR/Cas9 系统对水稻基因的编辑可以稳定遗传给下一代[14]，所以将该技术应用到水稻育种意义重大。

OsCOL9基因位于水稻第3染色体，cDNA全长2 055 bp，含有2个外显子和一个内含子，CDS序列全长1 266 bp，编码一个422 aa蛋白，分子量大小约为45.6 kDa，蛋白质结构的N端含有B-box结构域，C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1) 结构域。CCT蛋白可能是信号转导途径的主要效应子，锌指蛋白是常见的转录因子之一，B-box可能参与锌指蛋白与其他蛋白之间的互作。在本研究中，设计4个靶点，利用CRISPR/Cas9 技术对水稻抗病相关基因OsCOL9实行定点编辑，探索该方法的编辑效率及基因可能参与的信号通路。

1 材料和方法

1.1 CRISPR/Cas9及gRNA载体

CRISPR/gRNA载体以Amp抗性pUC18载体为骨架经过改造而获得，大小约为3 kb，如图1-A所示。为了便于gRNA表达盒的连接反应，采用BsaⅠ或BamHⅠ单酶切gRNA载体。为降低假阳性克隆出现，载体设计时将gRNA区排列在U3/U6启动子区上游，中间用载体骨架隔开，设计引物时选用靠近U3/U6启动子区以及gRNA区的载体骨架序列设计上下游引物，由于延伸时间(20 s)限制，未被酶切的载体不被PCR扩增。CRISPR/Cas9双元载体大小约为16.5 kb，如图1-B所示。该载体设置左右边界，从左往右依次排列由35S 启动子驱动的HPT基因、玉米泛素启动子Ubi驱动的Cas9基因、终止子、ccdB大肠杆菌致死基因。组装靶点时，可以使用AscⅠ或BsaⅠ单酶切CRISPR/Cas9双元载体，未酶切干净的载体，由于ccdB基因的存在会抑制大肠杆菌的生长，从而降低假阳性。这2个载体由华南农业大学刘耀光研究员馈赠。

图1 CRISPR/gRNA及Cas9载体示意图Fig.1 Feature of CRISPR/gRNA and Cas9 vectors

1.2 gRNA靶点选择及其寡核苷酸链引物的设计

本试验针对OsCOL9基因按照NGG序列，对靶序列进行Blast后筛选了4个靶点，分别在该基因CDS序列的起始密码子(ATG)后依次设计3个靶点U6a、U6b、U6c以及CDS的中部设计一个靶点(U3)，如表1所示，尽最大可能引起该基因密码子的缺失和移码。PCR鉴定阳性克隆引物，OsCOL9-CasF-Test：5′-CGCACTGTCGCTGACGTGTGG-3′，OsCOL9-CasR-Test：5′-TTCTGCTCGATCTGCTGCT-3′。

1.3 四靶点pYLCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA载体构建

载体的构建方法基于Ma等[15]报道的利用CRISPR/Cas9技术高效多重编辑单子叶。该方法主要分为三步：1.gRNA表达盒组装。利用PCR仪95 ℃处理30 s连接接头引物，酶切pYLCRISPR/gRNA载体，利用T4连接酶组装gRNA表达盒，根据不同启动子设计引物扩增gRNA表达盒。2.靶点与载体pYLCRISPR/Cas9组装。同时用BsaⅠ单酶切gRNA表达盒的扩增产物与CRISPR/Cas9载体，纯化回收后利用T4连接酶组装载体。在组装多靶点时，可以将酶切好的gRNA表达盒在20 ℃连接约10 min，再加入线性化的Cas9载体。3.转化以及阳性克隆检测。将10 μL的连接产物加入到100 μL的DH5α感受态细胞进行转化，挑选单克隆培养后抽提质粒，利用PCR以及AscⅠ酶切进行初步鉴定后进行测序分析。

表1 靶点寡核苷酸序列Tab.1 The oligonucleotide sequences of target sites

1.4 转基因植株的构建、水稻基因组DNA的提取以及突变体测序

通过农杆菌介导将表达载体转入到粳稻品种丽江中，包括诱导愈伤、侵染、2次筛选、分化、生根，得到转基因幼苗进行种植。采用CTAB法提取转基因水稻基因组DNA[16]。送Thermo Fisher Scientific公司完成测序。

2 结果与分析

2.1 pYLCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA双元载体组装结构以及酶切鉴定

本次试验针对OsCOL9基因设计了4个靶点，将组装好的gRNA表达盒替换Cas9载体骨架中的ccdB片段，得到pYLCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA双元载体(图2)。抽提单克隆的质粒，利用AscⅠ进行酶切鉴定，如图3所示，切出的目的片段大小约为2.0 kb左右，表明OsCOL9的4个靶点gRNA表达盒正确的组装到pYLCRISPR/Cas9载体上。通过设计特异性引物对构建载体上的各靶点进行测序，结果如图4所示，通过BsaⅠ位点组装的4个靶点序列都与所设计靶点序列(表1)一致，结果表明构建的载体适合用于下续的由农杆菌介导的水稻遗传转化中，为获得OsCOL9水稻突变体奠定基础。

图2 pLYCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA载体的组装图Fig.2 The structure of pLYCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA vectors

M.1 kb DNA ladder Marker；1.pYLCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA。

图4 四个靶点序列的测序结果Fig.4 Sequencing results for the four target sequences

2.2OsCOL9 转基因植株获得

利用农杆菌介导法将表达载体转入水稻材料易感病品种丽江(LTH)愈伤组织中，获得OsCOL9转基因植株，如图5所示，经Cas9敲除后，和野生型LTH相比，植株生长相对矮小，分蘖数减少，敲除后对抗病的影响需要进一步检测。

WT.野生型LTH；1-2.LTH的突变体。WT.Wild-type of LTH;1～2.Mutants of LTH.

2.3pYLCRISPR/Cas9-OsCOL9-gRNA 载体打靶效果检测

提取T1水稻叶片的基因组DNA，首先用潮霉素基因(HPT)检测引物进行PCR鉴定，筛选得到阳性的转基因植株。再利用设计的Cas9-OsCOL9检测引物对靶基因OsCOL9各个编辑位点上下游200 bp左右区域DNA片段进行扩增、测序，测序结果见图6。统计靶位点上下游碱基突变以及缺失情况，如表2所示，最多的碱基缺失数可达到59 bp，最少为1 bp，突变次数最多可达11次，由此表明，取得较好的基因编辑效果。

2.4 脱靶效应分析

由于Target 2靶位点的打靶效率较低，将Target 2靶点的序列与日本晴第3号染色体碱基序列Chr3：28000000-29000000进行比对分析得到可能出现脱靶的位点。结果表明，与靶序列相差3个碱基数的序列有3个，相差4个碱基数的靶点有5个，初步推测这些都是极易出现脱靶效应的位点(表3)。

表 2 OsCOL9 突变体与野生型序列对比结果Tab.2 Sequence alignment of OsCOL9 mutants compared to the WT line

表3 预测可能脱靶的位点Tab.3 The putative off-target sites

图6 OsCOL9突变体测序结果Fig.6 Sequencing results for OsCOL9 mutants

3 结论与讨论

CRISPR/Cas9是一种高效且简便的基因定点编辑技术。相对ZFN和TALEN 2种技术而言，用RNA替代组装蛋白，实现与靶基因的特异性识别与结合，使得该技术有更加简便灵活的可操作性[17]。目前，国内外该技术主要应用于靶基因的定点突变以及基因功能的研究，同时拓展该技术的应用范围，如Cas9多重分子工具箱的转录调控作用[18]，由sgRNA介导的转录激活活性[19]，dCas9介导靶基因的沉默表达[20]，大规模的打靶试验进行大规模的表型分析。

本研究中，通过构建多靶点gRNAs载体对水稻的OsCOL9基因进行打靶试验，获得一系列不同类型的OsCOL9突变体，T1OsCOL9突变率高达87%。在水稻中，利用CRISPR/Cas9系统进行靶基因定点编辑的突变率从0～100%都有报道[21-22]，试验结果表明多靶点同时进行定点编辑有利于突变体的获得。T1转基因植株中碱基缺失最多可达59 bp，最少为1 bp，由于缺失碱基较少，PCR扩增目的片段后，通过凝胶电泳检测无明显差异，因此通过测序检测突变位点。打靶过程中，以U6b、U6c为启动子驱动的2个靶点起到显著的效果。起始密码子ATG附近以U6a为启动子、外显子末端以U3a为启动子设计的2个靶点都出现了严重的脱靶现象，可能的原因有：①基因组内包含有与这2个靶点高度类似的碱基序列导致sgRNA结合时发生错配；将Target 2 和Target 3序列与日本晴第3染色体3：28000000-29000000序列进行比对，以4 bp碱基差为阀值得到与Target 2相似的序列有8个，Target 3为0个，以6 bp碱基差为阀值得到与Target 2相似的序列有38个，Target 3为5个，由此可以初步推论靶位点的特异性选择有利于降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应。②该基因外显子GC含量过高。GC含量过高可能不利于gRNA与靶序列的识别，增加脱靶机率。

CRISPR/Cas9系统介导的DNA切割，PAM为NGG应用最广泛，但有研究表明，PAM为NAG时，在人细胞中也有较高的切割效率，由此推测，非NGG 序列可能是导致脱靶的一个原因[23]。Sternberg等[24]研究表明，CRISPR/Cas9核酸酶结构域的构象直接控制DNA切割的效率，对打靶是否成功起关键性作用。PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件，可能不同PAM序列对CRISPR/Cas9核酸酶结构域的构象影响程度不同。本试验中gRNA使用U6启动子比U3启动子具有更好的打靶效果，从表1可以看出靶基因缺失、插入、突变的位点都在U6启动子靶点的附近，Mikami等[21]以OsYSA为靶点，对比CRISPR/Cas中U3和U6启动子驱动gRNA表达效率，结果表明U3突变率为0～53.3%，U6突变率为39.6%～80.0%，U6驱动gRNA表达更高效，Ma等[15]研究也表明U6的平均编辑效率较U3高。

降低CRISPR/Cas9系统脱靶效应同时又保持操作的简便性是该技术突破的关键。可以从以下2个方面着手：①设计特异性sgRNA。比如利用CRISPRscan设计模型运算预测得到高特异性的sgRNA[25]、张锋实验室开发的(http：//crispr.mit.edu/)[26]。②对Cas蛋白进行改造提高精准性。Kleinstiver等[27]使用改造后高保真核酸酶SpCas9-HF1进行打靶实验，通过全基因组范围内测序得到脱靶率为0。还有研究通过抑制非同源末端的连接来提高CRISPR/Cas9对基因组编辑的有效性以及精确性[28]。

T0靶基因的突变可以遗传给T1，到了T2可以检测到目标性状分离的现象[29-30]。该方法可得到纯合、杂合2种突变体，将突变体经过回交等一系列手段消除转基因的痕迹，结合传统的作物育种，将极大加快育种进程。该技术只能定点编辑基因组内源基因，因此不能明确定义该突变体为转基因植株，另外该技术是否属于转基因管理范畴进行监管有待于进一步研讨。

综上所述，本研究通过利用CRISPR/Cas9技术获得了类型较为丰富的OsCOL9突变体，为水稻抗病的研究提供了丰富的材料，且为水稻的抗病育种奠定了重要材料基础。该技术可以定点编辑植物的内源基因，产生多样的突变体获得丰富的水稻育种材料，开拓了高效、安全的育种途径，实现了理论与实践的相结合。降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应是推广应用该技术的关键，该系统在不同作物中诱导产生突变的效率、特异性、遗传性等问题的研究还不十分清楚，仍需大力投入和积极开展研究。

[1] Griggs D，Stafford-smith M，Gaffney O，et al. Policy：sustainable development goals for People and planet[J]. Nature，2013，495(7441)：305-307.

[2] Cathomen T，Joung J K. Zinc-finger nucleases：the next Generation emerges[J]. Molecular Therapy：the Journal of the American Society of Gene Therapy，2008，16(7)：1200-1207.

[3] Rémy S，Tesson L，Ménoret S，et al. Zinc-finger nucleases：a powerful tool for genetic engineering of animals[J]. Transgenic Research，2010，19(3)：363-371.

[4] Boch J，Scholze H，Schornack S，et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type Ⅲ effectors[J]. Science，2009，326(5959)：1509-1512.

[5] Haurwitz R E，Jinek M，Wiedenheft B，et al. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease[J]. Science，2010，329(5997)：1355-1358.

[6] Wyman C，Kanaar R. DNA double-strand break repair：All′s well that ends well[J].Annual Review of Genetics，2006：40，363-383.

[7] Gaj T，Gersbach C A，Barbas C F. ZFN，TALEN，and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering[J]. Trends in Biotechnology，2013，31(7)：397-405.

[8] Ishino Y，Shinagawa H，Makino K，et al. Nucleotide-sequence of the iap gene，responsible for alkaline-phosphatase isozyme conversion in escherichia-coli，and identification of the gene-product[J]. Journal of Bacteriology，1987，169(12)：5429-5433.

[9] Belhaj K，Chaparro-Garcia A，Kamoun S A，et al. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9[J]. Current Opinion in Biotechnology，2015，32：76-84.

[10] Schaeffer S M，Nakata P A. CRISPR/Cas9-mediated genome editing and gene replacement in plants：transitioning from lab to field[J]. Plant Science，2015，240：130-142.

[11] Miao J，Guo D，Zhang J，et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system[J]. Cell Research，2013，23(10)：1233-1236.

[12] Shan Q W，Wang Y P，Li J，et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology，2013，31(8)：686-688.

[13] Xing H L，Dong L，Wang Z P，et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants[J]. BMC Plant Biology，2014，14(1)：327.

[14] Nekrasov V，Staskawicz B，Weigel D，et al. Targeted mutagenesis in the model plantNicotianabenthamianausing Cas9 RNA-guided endonuclease[J]. Nature Biotechnology，2013，31(8)：691-693.

[15] Ma X，Zhang Q，Zhu Q，et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient，high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J]. Molecular Plant，2015，8(8)：1274-1284.

[16] Wang H N，Chu Z，Ma X，et al. A high through-put protocol of plant genomic DNA preparation for PCR[J]. Acta Agron Sin，2013，39：1-6.

[17] Jinek M，Chylinski K，Fonfara I，et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science，2012，337(696)：816-821.

[18] Lowder L G，Zhang D，Baltes N J，et al. A CRISPR/Cas9 toolbox for multiplexed plant genome editing and transcriptional regulation[J]. Plant Physiology，2015，169(2)：971-985.

[19] Konermann S，Brigham M D，Trevino A E，et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex[J]. Nature，2015，517(7536)：583-588.

[20] Thakore P I，D′ippolito A M，Song L，et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements[J]. Nature Methods，2015，12(12)：1143-1149.

[21] Mikami M，Toki S，Endo M. Comparison of CRISPR/Cas9 expression constructs for efficient targeted mutagenesis in rice[J]. Plant Molecular Biology，2015，88(6)：561-572.

[22] Zhou H，Liu B，Weeks D P，et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J]. Nucleic Acids Research，2014，42(17)：10903-10914.

[23] Zhang Y L，Ge X L，Yang F Y，et al. Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells[J]. Scientific Reports，2014，4:5405.

[24] Sternberg S H，Lafrance B，Kaplan M，et al. Conformational control of DNA target cleavage by CRISPR-Cas9[J]. Nature，2015，527(7576)：110-113.

[25] Moreno-Mateos M A，Vejnar C E，Beaudoin J D，et al. CRISPRscan：designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targetinginvivo[J]. Nature Methods，2015，12(10)：982-988.

[26] Hsu P D，Scott D A，Weinstein J A，et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases[J]. Nature Biotechnology，2013，31(9)：827-832.

[27] Kleinstiver B P，Pattanayak V，Prew M S，et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects[J]. Nature，2016，529(7587)：490-495.

[28] Maruyama T，Dougan S K，Truttmann M C，et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining[J]. Nature Biotechnology，2015，33(5)：538-542.

[29] Chiu H，Schwartz H T，Antoshechkin I，et al. Transgene-free genome editing inCaenorhabditiselegansusing CRISPR-Cas[J]. Genetics，2013，195(3)：1167-1171.

[30] Xu R F，Li H，Qin R Y，et al. Generation of inheritable and "transgene clean" targeted genome-modified rice in later generations using the CRISPR/Cas9 system[J]. Scientific Reports，2015，33(5)：11491.

MutantedOsCOL9 Based on CRISPR/Cas9 Technology in Rice

LIU Wei,LIU Hao,DONG Shuangyu,GU Fengwei,CHEN Zhiqiang,WANG Jiafeng,WANG Hui

(National Engineering Research Center of Plant Space Breeding，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

The CRISPR/Cas9 system can directly to edit endogenous genomic loci in plant,provide a new opportunities for crop breeding.To explore the editing efficiency of the system on rice endogenous gene and obtain meaningful mutants,using the susceptible rice variety Lijiang and the disease resistance geneOsCOL9 as the target gene.The full-length CDS ofOsCOL9 was 1 266 bp long and encoding a 422 aa protein with a molecular weight of about 45.6 kDa,and the N-terminus contained the B-box domain,and the C-terminus contains the CCT (CONSTANS，CONSTANS-Like，TOC1) domain.In this study,four 20 nt guide RNAs (gRNAs) which were targeted to the initiation region CDS and terminal exon ofOsCOL9 were designed and transcribed from the U3，U6a，U6b and U6c promoters，respectively. The sequences near the editing site were analyzed by extracting genomic DNA from T1 transgenic plants.The number of target base deletions was 59 bp and the number of mutations was up to 11 times .In this study,we get better gene editing results.However，there have been more serious off-target effects in this experiment.Therefore，we focus on off-target effects in the discussion section of this paper. Owing largely to its flexibility，efficiency and no insertion of exogenous gene，it has important practical significance to combine biotechnology and traditional breeding.

Rice；Genome editing；CRISPR/Cas9;OsCOL9

2017-06-11

国家计划项目(2007AA1090101)；国家自然科学基金项目(31401722)

刘 维(1993-)，女，湖南衡阳人，在读硕士，主要从事水稻抗稻瘟病研究。

王 慧(1965-)，女，湖南长沙人，教授，博士，硕士生导师，主要从事高产优质常规稻育种研究。

Q78；S572.03

A

1000-7091(2017)04-0042-07

10.7668/hbnxb.2017.04.007