《正骨先行散》药品质量标准研究

杨思广 费丽娜 毕 娜

《正骨先行散》药品质量标准研究

杨思广 费丽娜 毕 娜

目的就正骨先行散的原材料检验方法及注意事项进行分析。方法通过显微鉴别、薄层色谱分别对三七、龙血竭等中药成分进行鉴别，鉴别的过程进行系统剖析，并对鉴别过程中的关键环节和重点步骤做归纳和总结。结果茯苓、三七、龙血竭等中药成分显微鉴别特征明显，三七、龙血竭、红花等中药成分薄层色谱结果重复性良好。结论该方法简便易行，准确可靠，可用于正骨先行散的质量控制。

正骨先行散；显微鉴别；薄层色谱；三七；龙血竭；当归

正骨先行散是由红花、龙血竭等中药成分组成的医院自制纯中药制剂，具有活血行气、消肿、润肠、止痛之功效，主要用于骨折初期，在临床中有较好的疗效。为有效控制其质量，根据该品种的药味及制法，对茯苓、三七、龙血竭等中药成分采用显微鉴别，用薄层色谱法对三七、龙血竭、红花等中药成分进行定性鉴别。

1 试剂与试药

1.1 样品实验所用的中成药、阴性对照来源均由某医院提供。正骨益中散，批号：20150715-1、20150715-2、20150715-3。

1.2 对照品人参皂苷 Rb1，批号：110704-200318（含量测定用）；人参皂苷Rg1，批号：110703-200425（含量测定用）；三七皂苷 R1，批号：0745-200109（含量测定用）；龙血竭，批号：121252-201303；延胡索乙素，批号：110726-200107（含量测定用）；红花，批号：120907-201412；当归，批号：120927-200613，上述对照品均来自中国食品药品检定研究院。

1.3 薄层板硅胶G预制板、硅胶H预制板由青岛海洋化工厂分厂提供。薄层色谱所用试剂均为分析纯。

1.4 原料来源

1.4.1 三七五加科植物三七 Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen去除水分的根及根茎。秋日开花前采集，清洗，将主根和支根以及根茎分开，进行干燥处理。支根俗称“筋条”，根茎俗称“剪口”[1]，清热、平肝、降压，也适用于心脑血管疾病的治疗[2]。

1.4.2 龙血竭百合科植物剑叶龙血树Dranaena cochinchinensis（Lour.）S.C.Chen含酯木材，其经提取得到的树脂[1]。

1.4.3 红花菊科植物红花 Carthamus tinctorius L.干制花。每年夏日花从黄转为红色时采收，进行阴干、晒干[1]。

1.4.4 当归本品为伞形科植物当归 Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根[1]。研究表明，当归及其有效成分藁本内酯类、香豆素类、黄酮类、有机酸及氨基酸等[3]。

1.4.5 乳香为橄榄科植物乳香树Boswellia carterii Birdw.及其同属植物Boswellia bhaw-dajiana Birdw.收集树皮溢出树脂。

1.4.6 延胡索系罂粟科植物延胡索 Corydalis yanhusuo W.T.Wang干燥的块状茎。含近20种生物碱：D-紫堇碱（D-Corgdaline，即延胡索甲素）、DL-四氢巴马亭（DL-Tetrahydropalmatine，即延胡索乙素）、后鸦片碱（Protopine，即延胡索丙素）、L-四氢黄连碱（L-Tetrahydrocoptisine，即延胡索丁素）等[4]。

1.4.7 茯苓系多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos（Schw.）Wolf干燥的菌核。

1.4.8 桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch 或山桃Prunus davidianan（Carr.）Franch.成熟后干燥的种子。桃仁含苦杏仁甙（Amygdalin），含量约为苦杏仁的1/2，并含苦杏仁酶（Emulsin）、尿囊素酶（Allontoinse）、乳糖酶、维生素B1及多量脂肪油[5]。

1.4.9 枳壳系为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.以及栽培变种经干燥处理的未成熟果实。

2 方法与结果

根据该品种的处方药味及制法，拟依次进行显微、薄层色谱法定性鉴别，列入【鉴别】（1）（2）（3）（4），以确保该药物的内在质量。

2.1 显微鉴别

2.1.1 三七显微特征可观察到较多的淀粉粒，颗粒可呈圆、半圆或圆多角形，其直径多在4～30 μm之间；复粒由 2～10余分淀粉粒聚合而成。可观察到具黄色分泌物的树脂道碎片。鉴别中可见管直径15～55 μm，梯纹、网纹导管和螺纹导。较少见草酸钙簇晶，其直径在50～80 μm之间。其中“树脂道碎片含黄色分泌物”，经粉碎同其他药粉混合后被破坏，几乎无法观察，故在正文中未收载其显微鉴别项。

2.1.2 红花显微特征显微鉴别多可观察到花冠、花丝、柱头的碎片，可见直径约66 μm的长管状分泌细胞，其常在导管旁，分泌细胞含类黄棕或红棕色的分泌物质。可见花冠裂片顶部的表皮细胞，细胞壁外壁突起为短绒毛状。可见柱头和花柱上部的表皮细胞，表皮细胞分化为圆锥形的单细胞毛，其先端呈尖或稍钝状。花粉粒有3个萌发孔，外壁齿状的突起，花粉颗粒呈现直径约为60 μm的类圆形、椭圆形或橄榄形。可见薄壁细胞中存在直径2～6 μm的草酸钙方状结晶。其中“分泌细胞直径约至66 μm，含黄棕色至红棕色分泌物。花粉粒类圆形、椭圆形或橄榄形，直径约至60 μm，具3个萌发孔，外壁有齿状突起”。特征较为明显，且无其他干扰，在正文中收载其显微鉴别项（图1）。

2.1.3 龙血竭显微特征不规则块片血红色，周围液体显鲜黄色，渐变红色。特征较为明显，且无其他干扰，在正文中收载其显微鉴别项（图1）。

2.1.4 当归显微特征韧皮薄壁细胞的细胞壁略厚，呈纺锤形，可观察到极微细的斜向交错纹理，偶尔可见其中菲薄的横隔。鉴别中直径80 μm左右的梯纹导管及网纹导管较为多见。偶尔可观察到油室碎片。其中“韧皮薄壁细胞纺锤形，壁略厚，表面有极微细的斜向交错纹理，有时可见菲薄的横隔”，经粉碎同其他药粉混合后被破坏，几乎无法观察，故在正文中未收载其显微鉴别项。

2.1.5 乳香显微特征《中国药典》2010年版一部乳香项下无显微鉴别，并且乳香无研究报道。故在正文中未收载其鉴别项。

2.1.6 延胡索显微特征糊化淀粉粒团块淡黄色或近无色。下皮厚壁细胞绿黄色，细胞多角形、类方形或长条形，壁稍弯曲，木化，有的成连珠状增厚，纹孔细密。螺纹导管直径16～32 μm。该显微特征不明显，故在正文中未收载其显微鉴别项。

2.1.7 茯苓显微特征鉴别中可见不规则的颗粒状团块以及分枝状的团块，其无色，加入合氯醛液，可见其渐溶。菌丝呈稍弯曲状，有分枝。多为无色或淡棕色，直径3～8 μm，少数直径至16 μm。其中“不规则颗粒状团块和分枝状团块无色，遇水合氯醛液渐溶化”特征较为明显，且无其他干扰，在正文中收载其显微鉴别项（图1）。

图1 显微鉴别（1红花2龙血竭3茯苓）

2.1.8 桃仁（燀桃仁）显微特征桃仁显微特征为种皮石细胞。桃仁经燀制后，已经除去种皮，燀桃仁无显微特征，故在正文中未收载其显微鉴别项。

2.1.9 枳壳显微特征鉴别中可观察到中果皮细胞。细胞呈类圆形或为不规则形状，细胞壁大多呈现不均匀的增厚状。果皮的表皮细胞，其表面观为多角形、类方形及长方形，呈现直径在 16～34 μm之间的气孔环式，具副卫细胞5～9个；侧面观可见外被角质层。汁囊组织的细胞多呈皱缩状，颜色为淡黄色或无色，并且和下层的细胞相交错排列。在果皮和汁囊细胞中可观察到呈斜方形、多面体形、双锥形，直径在3～30 μm之间的草酸钙方状结晶存在。螺纹导管、网纹导管及管胞细小。其显微特征不明显，故在正文中未收载其显微鉴别项。

2.2 薄层色谱

2.2.1 三七鉴别实验①溶液的制备：供试品溶液的制备：称取本品10 g，向其中加入甲醇50 ml，超声预处理 60 min，对其进行过滤，将滤液蒸干并加水40 ml溶解残渣，以水饱和正丁醇分3次振摇提取，每次加入25 ml，最后合并正丁醇的提取溶液，使用20 ml的1%氢氧化钠溶液进行洗涤，洗涤2次后弃去 1%氢氧化钠溶液。再用正丁醇饱和水溶液每次20 ml，分别洗涤2次，最终弃去水洗液，将正丁醇液蒸干，向其中加入甲醇1 ml溶残渣，即为供试品溶液。对照品溶液的制备：分别称取三七皂苷 R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对照品，加入甲醇，配制成1 mg/ml的混合对照品溶液，即为鉴别用对照品溶液。阴性对照溶液的制备：取不含三七的阴性对照品，依据供试品溶液的前处理方法进行处理，即为鉴别用阴性对照溶液。

②方法：实验温度：15 ℃；相对湿度：18%；展距：8 cm；点样量：上述三种溶液各5 μl；薄层板：硅胶G薄层板；展开剂：使用氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水比例为15:40:22:10的混合溶液为展开剂，10 ℃以下放置的下层溶液；显色：均匀喷以硫酸乙醇溶液（10%），加热至105 ℃至斑点显色清晰明显。

③结果：供试品色谱中与对照品色谱在其相对应的位置，呈现同色斑点；置于波长365 nm的紫外光灯下检视，可见清晰同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰。故在正文中收载其薄层鉴别项。三批样品按上述方法检测，结果重现性良好，如图2。

图2 三七的薄层色谱图

2.2.2 龙血竭鉴别实验①溶液的制备：供试品溶液的制备：称取供试品5g，向其中加入乙醚30 ml，进行15 min超声处理，进行过滤，并对滤液进行蒸干处理，再加入甲醇1 ml溶解残渣，即为供试品溶液。对照药材溶液的制备：称取龙血竭对照药材0.5 g，按照供试品的处理方式，制备成对照药材溶液。阴性对照溶液的制备：取不含龙血竭的阴性对照品，按照上述供试品溶液的处理方式，制备成阴性对照溶液。

②方法：实验温度：15℃；相对湿度：18%；展距：8 cm；点样量：上述三种溶液各10 μl；薄层板：硅胶 G；展开剂：环己烷-乙酸乙酯（5:1）；显色：放置于波长为365 nm紫外光灯下进行检视。

③结果：供试品色谱与对照药材色谱在其相对应的位置，呈现相同颜色荧光斑点，且阴性色谱未见干扰。故在正文中收载其薄层鉴别项。三批样品按上述方法检测，结果重现性良好，如图3。

图3 龙血竭的薄层色谱

2.2.3 红花鉴别实验①溶液的制备：供试品溶液的制备：称取1 g本品固体粉末，向其中加入10 ml丙酮溶液（80%），密封后连续振摇约20 min，经静置一段时间后分层，取其上层清液，即为供试品溶液。对照药材溶液的制备：另外称取1 g红花对照药材，按上述步骤制成鉴别用对照药材溶液。阴性对照溶液的制备：取不含红花的阴性对照，按上述步骤对阴性样品进行出来，即为阴性对照溶液。

②方法：实验温度：15℃；相对湿度：18%；展距：8 cm；点样量：上述三种溶液各5 μl；薄层板：硅胶 H；展开剂：乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7:2:3:0.4）；显色：日光下进行检视。

③结果：供试品色谱与对照药材色谱相对应的位置，没有出现同样颜色斑点。故在正文中未收载其薄层鉴别项。三批样品按上述方法检测，结果重现性良好，如图4。

图4 红花的薄层色谱

2.2.4 延胡索鉴别实验①溶液的制备：供试品溶液的制备：称取5 g供试样品，向其中加甲醇25 ml，进行超声预理 20 min，经过滤后，将其滤液进行蒸干，并加水20 ml溶解残渣，使用浓氨试液对pH值进行调节，使pH值在9～10之间。分别用30 ml乙醚对其进行振摇提取 2次，对溶液进行合并，使其挥干后加入甲醇1 ml溶解残渣，即为供试品溶液。对照品溶液的制备：称取延胡索乙素的对照品，加入甲醇配制为1 mg/ml的溶液，作为鉴别试验对照品溶液。阴性对照溶液的制备：称取不含延胡索的阴性对照品，依据上述供试品溶液处理步骤，配制鉴别用阴性对照溶液。

②方法：实验温度：15℃；相对湿度：18%；展距：8 cm；点样量：上述三种溶液各5 μl；薄层板：1%氢氧化钠溶液制备硅胶 G；展开剂：比例为环己烷-氯仿-甲醇10:4:1的混合试剂为展开剂；显色：碘蒸气熏至斑点显色清晰，挥尽板上吸附的碘后，置于波长为365 nm紫外光灯下进行检视。

③结果：供试品色谱与对照品色谱，在其相对应的位置，无荧光斑点。故在正文中未收载其薄层鉴别项。三批样品按上述方法检测，结果重现性良好，如图5。

图5 延胡索的薄层色谱

2.2.5 乳香鉴别实验《中国药典》2010年版一部乳香项下无薄层鉴别，并且乳香无研究报道。故在正文中未收载其鉴别项。

2.2.6 当归鉴别实验①溶液的制备：供试品溶液的制备：取本品3 g，向其中加20 ml的乙醚试剂，进行超声预处理 10 min，对其进行过滤，其滤液即为供试品溶液。对照药材溶液的制备：另称取1 g当归的对照药材，向其中加20 ml乙醇试剂，超声预处理20 min，经过滤，滤液即为鉴别用对照药材溶液。阴性对照溶液的制备：称取不含乳香的阴性对照品，按照上述供试品溶液的处理方法，即可配制成鉴别用阴性对照溶液。

②方法：实验温度：15℃；相对湿度：18%；展距：8 cm；点样量：上述三种溶液各5 μl；薄层板：硅胶 G；展开剂：正己烷-乙酸乙酯（9:1）；显色：放置在波长为365 nm的紫外光灯下进行检视。

③结果：在供试品色谱与对照药材色谱的相对应位置，具有相同颜色荧光斑点，并且阴性色谱没有干扰。故在正文中收载其薄层鉴别项。三批样品按上述方法检测，结果重现性良好，如图6。

图6 当归的薄层色谱

3 讨论

正骨先行散具有活血行气、消肿、润肠、止痛之功效，主要用于骨折初期，在临床中有较好的疗效，但本制剂目前没有科学、严谨的质量标准进行控制，无法保证制剂本身的质量稳定可控，给临床使用也带来了一定的用药风险。为有效控制其质量，根据该品种的药味及制法，对茯苓、三七、龙血竭等中药成分采用显微鉴别实验，用薄层色谱法对三七、龙血竭、红花等中药成分进行定性鉴别实验，通过对原材料的质量进行严格控制，从而保证制剂本身的质量能满足现行版药典的相关中药质量标准项下要求。本质量标准起草过程中，对显微鉴别和薄层色谱鉴别试验中的实验条件和检验方法注意事项进行实验摸索，并采用大量实验数据进行充分论证。本质量标准通过显微鉴别、薄层色谱分别对三七、龙血竭等中药成分进行鉴别，鉴别的过程进行系统剖析，并对鉴别过程中的关键环节和重点步骤进行归纳和总结，从而制定订出简便易行，实验结果重复性好、准确度高、专属性强的质量控制方法，确保正骨先行散制剂质量稳定可靠。

本研究结果显示，采用显微鉴别法对正骨先行散中的茯苓、三七、龙血竭、红花、当归、乳香、延胡索、桃仁进行鉴别，其显微鉴别特征明显，且结果稳定可靠。采用薄层色谱法对三七、龙血竭、红花、延胡索、当归进行鉴别，试验重复性良好，简便易行、结果准确可靠。

正骨先行散无相应的质量控制标准，无法达到相关监督管理部门的要求，故对其进行了显微鉴别和薄层鉴别的研究，建立茯苓、三七、龙血竭、红花、当归、乳香、延胡索、桃仁的显微鉴别方法和三七、龙血竭、红花、延胡索、当归的薄层鉴别方法，经过科学严谨的方法学研究，方法重现性良好，操作简单、快捷，结果稳定、准确、可靠，能够实现对正骨先行散药品内在质量真伪的控制。可以确保该药的内在质量，取得满意的效果。

[1] 中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2015:11,151,133.

[2] 黄文琴.三七的临床应用功效及药理分析[J].医学信息(中旬刊),2011,24(1):304.

[3] 李素琴,李雪芸.当归化学成分及药理作用研究进展[J].大家健康(学术版),2016,10(2):283.

[4] 陈佳,钱琛,陈桂良.《中华人民共和国药典(2015年版)》中中药部分的增、修订情况简介[J].上海医药,2016,37(7):3-4,8.

[5] 韩鹏然,白明,苗明三.《中华人民共和国药典》2010年版中药外用功能分析[J].中医学报,2013,28(6):863-864.

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.08.011

吉林省吉林市食品药品检验所，吉林吉林 132000

杨思广（1990.10-），本科学历，初级药师。研究方向：中药