克罗恩病患儿血清细胞因子水平的研究

卢华君，赵忠艳，林小春，方玲娟，闫秀梅，黄开宇

(温州医科大学附属第二医院 育英儿童医院儿童消化科，浙江 温州 325027)

克罗恩病患儿血清细胞因子水平的研究

卢华君，赵忠艳，林小春，方玲娟，闫秀梅，黄开宇

(温州医科大学附属第二医院 育英儿童医院儿童消化科，浙江 温州 325027)

目的 通过研究克罗恩病(CD)患儿血清细胞因子水平，探讨其在儿童CD发病与发展中的作用。方法 采用流式微球分析技术，检测2013年1月至2015年12月在温州医科大学附属第二医院住院的32例CD患儿和30名正常对照儿童的血清白介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IL-17A水平，并进行统计分析。结果 CD患儿血清中的IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17A水平均显著高于正常对照组(t值分别为2.822、2.643、5.713、2.962、3.183，均P<0.05)；而血清中的IL-10、IFN-γ水平则显著低于正常对照组(t值分别为2.554、2.634，均P<0.05)。此外，儿童CD活动指数(PCDAI)评分为中重度的患儿血清TNF-α、IL-2和IL-17A水平显著高于评分为轻度的患儿(t值分别为2.233、2.332、2.531，均P<0.05)；而血清IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-10水平的PCDAI评分则中重度活动与轻度活动CD患儿差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论 与正常儿童相比，CD患儿存在明显细胞因子水平变化，而且疾病活动度不同其细胞因子水平亦有差异，提示细胞因子水平紊乱在儿童CD发病及病情的发展中有重要作用。

克罗恩病；细胞因子；流式细胞术；儿童

克罗恩病(Crohn’s disease，CD)是一种非特异性的消化道炎症性疾病，病变可累及消化道的各个部位，特别是末段回肠和结肠，也可累及全身各个系统。该病临床表现复杂，发病机制也不完全清楚。既往研究支持CD是一种肠道免疫平衡失调的表现，涉及多种炎症细胞与炎症介质的作用。儿童CD为早期发病亚型，与成人CD相比，对儿童CD研究相对滞后。因此，研究CD患儿的免疫应答变化有助于阐明儿童CD的致病机理，对于指导对CD患儿的治疗有重要意义。本研究拟通过检测CD患儿血清中白介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ等细胞因子水平，分析其与儿童CD的关系，探讨儿童CD的发病机制及个体的免疫应答情况。

1对象和方法

1.1研究对象及分组

病例组为2013年1月至2015年12月在温州医科大学附属第二医院儿童内科住院的CD患儿32例，其中男18例，女14例，年龄7～15(8.5±4.3)岁。所有病例经过胃肠镜、影像学和组织病理学检查，结合临床表现确诊，诊断标准参考有关文献[1]。病例采用儿童CD活动指数(PCDAI)对患儿疾病活动度进行评分，0～10分为不活动，11～30分为轻度活动，≥31分为中/重度活动。32例CD患儿包括轻度活动12例，中重度活动20例，无不活动患儿。正常对照组为30名同期在本院门诊体检的健康儿童，其中男18例，女12例，年龄6～13(10±3.5)岁。两组年龄、性别比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。病例组和对照组所有儿童均晨起空腹用干燥试管采集静脉血2mL用于细胞因子水平检测。

1.2细胞因子的检测

干燥试管采集的静脉血静置后离心取得血清，用EP管分装，置-80℃冰箱保存备用。采用流式微球分析(cytometric bead assay，CBA)技术检测血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A这7种细胞因子水平。细胞因子检测试剂盒由BD公司提供。检测方法参考有关文献[2]。

1.3统计学方法

2结果

2.1两组儿童血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10的检测结果

病例组患儿血清IL-2、IL-4和IL-6水平明显高于对照组，而血清IL-10水平则明显低于对照组，两组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1 两组儿童血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10水平的比较结果

2.2两组儿童血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A的检测结果

病例组患儿血清中TNF-α、IL-17A水平明显高于对照组，而IFN-γ水平则明显低于对照组，两组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

2.3中重度活动与轻度活动克罗恩病患儿血清中IL-2、IL-4、IL-6和IL-10水平的比较

血清IL-2水平在中重度活动组显著高于轻度活动组(P<0.05)，而两组患儿血清中IL-4、IL-6和IL-10水平差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表3。

表2 两组儿童血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平的比较结果

表3 不同活动度CD患儿血清中IL-2、IL-4、IL-6和IL-10水平的比较结果

2.4中重度活动与轻度活动克罗恩病患儿血清中TNF-α、IFN-γ和IL-17A水平的比较

中重度活动患儿血清TNF-α和IL-17A水平均显著高于轻度活动患儿(均P<0.05)，而两组患儿血清IFN-γ水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 不同活动度CD患儿血清中TNF-α、IFN-γ和IL-17A水平的比较结果

3讨论

3.1儿童克罗恩病的临床特征

儿童CD是一种发生于儿童时期的非特异性的消化道慢性炎症性疾病。目前国内儿童CD发病率尚无确切报道，国外资料显示儿童CD的发病率为5/10万～6.6/10万，且呈逐渐上升趋势[3-4]。由于儿童CD临床表现不典型且缺乏特异性实验室检查，诊断比较困难。儿童CD的诊断需要根据临床表现并结合辅助检查综合判断。儿童CD临床主要表现为腹痛、腹泻、血便，其中腹痛最常见[5]。部分病例可表现为肠套叠、肠梗阻；部分患儿在病程中可出现发热。此外，儿童CD往往存在消瘦、贫血、低蛋白血症等营养不良表现。针对儿童CD的主要辅助检查手段包括影像学检查、消化内镜检查、组织病理学检查等。腹部B超能监测肠壁的血供及动力状态，发现肠壁的不均匀性、阶段性增厚情况，可作为儿童CD诊断时的有效线索。消化内镜检查是诊断儿童CD的必要手段，内镜下儿童CD病变主要表现为黏膜破坏和慢性增生同时存在，典型病例能见到纵行裂隙状溃疡及铺路石样改变，但在早期病变不典型的情况下，易与肠结核、溃疡性结肠炎、肠道肿瘤等疾病相混淆。儿童CD的组织病理学改变无特异性，以黏膜的慢性非特异性炎症改变为主，有时可见干酪性肉芽肿。因此病理学表现在疾病诊断早期仅能作为参考条件。血常规、血沉及C-反应蛋白、血浆白蛋白在疾病活动期均有不同程度的改变，可作为监测疾病活动情况的有效指标[6]。

3.2儿童克罗恩病的发病机制

儿童CD的发病机制目前不清楚，其病因学一直是研究的热点。目前认为CD的发病与遗传、环境、感染和免疫等多种因素相互作用有关，属于自身免疫性疾病的一种，免疫调节紊乱是其发病的关键因素。肠道的免疫平衡是由调节性T细胞和免疫性T细胞调控，免疫性T细胞可以分为辅助性T细胞(Th)以及细胞毒性T细胞。如果免疫性T细胞过度增生、免疫原性增强，或调节性T细胞数量减少、功能异常，均可打破两者平衡，从而诱发CD，导致肠黏膜损伤。在CD的免疫应答中，Th是主要的参与者。Th在不同细胞因子的刺激下，可以分为Th1、Th2。Th1型细胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等；Th2型细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等。目前认为CD的发病是以Th1介导为主，其中TNF-α已引起广泛注意。有研究表明，TNF-α是CD发病中一个重要的促炎因子[7]。动物实验研究发现，去除小鼠T细胞TNF-α基因的3'非翻译区会导致TNF-α水平升高并产生CD样的表型，形成节段性累及肠壁全层的肉芽肿性肠炎[7]。本研究中CD患儿血清IFN-γ和IL-10明显低于正常对照组，而IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IL-17A水平则明显高于对照组。IFN-γ是最典型的Th1型细胞因子，具有抗炎症活性，其降低可能导致机体抵抗炎症反应的能力降低。与正常对照组儿童相比，CD患儿血清IL-10浓度降低，提示可能由于存在某种因素抑制了IL-10的产生，导致不能削弱机体的细胞免疫反应，细胞因子网络失衡。由于IL-4的异常升高可刺激B细胞分泌IgE，而IFN-γ是一个IgE合成的潜在抑制物，那么IL-4与IFN-γ的失衡就可能使患儿IgE水平增高，从而引起了一系列肠黏膜炎症改变。CD患儿血清IL-2水平的升高，可能与多种细胞因子水平的变化并相互诱生有关。CD患儿巨噬细胞合成并分泌大量TNF-α，直接损伤血管内皮细胞，加重了消化道组织的损伤。而消化道组织的损伤又促使TNF-α因子的释放，形成恶性循环，造成消化道炎症反应的反复发生和迁延不愈。Th17细胞是一群新近鉴定的CD4+效应T细胞，该细胞分泌IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-23等细胞因子，具有很强的促炎症作用，其中最主要的是IL-17A，其与Th1、Th2、调节性T细胞一起广泛参与了机体的免疫防御及免疫调节过程。IL-17可能通过激活细胞因子、趋化因子，增加TNF-α诱导的消化道平滑肌细胞的IL-6表达，从而促进中性粒细胞的成熟和激活。Strober等[8]研究发现，在CD患者肠道炎症黏膜中，Th1相关的细胞因子(如TNF-α、IFN-γ)和Th17相关细胞因子(如IL-17A)显著升高，与本研究CD患儿血清细胞因子变化相类似。本研究还发现，中重度活动CD患儿血清TNF-α、IL-2和IL-17A水平显著高于轻度活动CD患儿，而IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-10水平则均无显著性差异，提示TNF-α、IL-2和IL-17A在儿童CD疾病发展及活动中可能起重要作用。

3.3儿童克罗恩病的治疗

儿童CD的治疗目前尚无统一且绝对有效的方案。除了一般营养治疗外，糖皮质激素、5氨基水杨酸(5-ASA)、6-巯基嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉秦、沙利度胺等均可用于儿童CD的治疗。有研究者认为，CD患儿在患病早期应用抗TNF-α制剂治疗的效果优于一般免疫治疗[7]。英夫利西(infliximab，IFX)为抗TNF-α单克隆抗体，可通过与巨噬细胞和T细胞表面表达的TNF-α高亲和力结合而拮抗TNF-α的生物活性。通过抗体依赖性细胞毒作用、补体依赖性细胞毒作用及影响细胞的信号转导途径，最终加速细胞周期阻滞、凋亡及抑制细胞因子产生[9]。

本研究结果提示，与健康儿童相比，CD患儿存在血清细胞因子水平的紊乱，而且疾病活动度不同其细胞因子水平亦有差异，提示细胞因子水平紊乱在儿童CD发病及病情的发展中有重要作用。如果能深入探讨CD患儿的免疫应答变化，将有助于阐明儿童CD的发病机制及进行个体化免疫干预治疗。

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[2]卢华君,赵忠艳,李云芳,等.呼吸道腺病毒感染患儿细胞因子及淋巴细胞亚群的研究[J].中国人兽共患病学报,2013,29(8):808-811,816.

[3]Adamiak T, Walkiewicz-Jedrzejczak D, Fish D,etal.Incidence,clinical characteristics, and natural history of pediatric IBD in Wisconsin:a population-based epidemiological study[J].Inflamm Bowel Dis,2013,19(6):1218-1223.

[4]Urlep D, Trop T K, Blagus R,etal.Incidence and phenotypic characteristics of pediatric IBD in northeastern Slovenia, 2002—2010[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2014,58(3):325-332.

[5]唐硕,吴小平,游洁玉.儿童克罗恩病10例临床分析[J].中国当代儿科杂志,2014,16(8):824-828.

[6]De Greef E, Mahachie John J M, Hoffman I,etal.Profile of pediatric Crohn's disease in Belgium[J].J Crohns Colitis,2013,7(11):e588-e598.

[7]Walters T D, Kim M O, Denson L A.Increased effectiveness of early therapy with anti-tumor necrosis factor-α vs an immunomodulator in children with Crohn’s disease[J].Gastroenterology,2014,146(2):383-391.

[8]Strober W, Fuss I J.Proinflammatory cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases[J].Gastroenterology,2011,140(6):1756-1767.

[9]吴芳,占强.英夫利西单抗治疗克罗恩病中免疫平衡及细胞因子的变化和意义[J].医学综述,2012,18(23):3947-3949.

[专业责任编辑：肖延风]

Serum cytokine level in children with Crohn’s disease

LU Hua-jun, ZHAO Zhong-yan, LIN Xiao-chun, FANG Ling-juan, YAN Xiu-mei, HUANG Kai-yu

(DepartmentofPediatricGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalandYuyingChildren’sHospitalofWenzhouMedicalUniversity,ZhejiangWenzhou325027,China)

Objective To explore the serum cytokine level in children with Crohn’s disease (CD) and to investigate its relationship with incidence and development of CD in children. Methods Serum interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, tumor necrosis factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ and IL-17A levels in 32 children with CD hospitalized in Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University from January 2013 to December 2015 and in 30 healthy children were detected using flow cytometry and test results were analyzed statistically. Results Serum levels of IL-2, IL-4, IL-6, TNF-α and IL-17A in children with CD were significantly higher than those in healthy controls (tvalue was 2.822, 2.643, 5.713, 2.962 and 3.183, respectively, allP<0.05), while serum levels of IL-10 and IFN-γ in CD children were much lower than those in healthy controls (tvalue was 2.554 and 2.634, respectively, bothP<0.05). In addition, serum levels of TNF-α, IL-2 and IL-17A in moderate and severe cases identified by pediatric Crohn’s disease activity index (PCDAI) were significantly higher than in mild cases (tvalue was 2.233, 2.332 and 2.531, respectively, allP<0.05). But serum levels of IFN-γ, IL-4, IL-6 and IL-10 in moderate and severe cases identified by PCDAI had no significant difference compared to those in mild cases (allP>0.05). Conclusion Compared to healthy children, serum cytokine levels in children with CD change significantly, and cytokine levels are different in cases at different degree of disease activity, indicating that cytokine level disorder may play an important role in incidence and development of pediatric CD.

Crohn’s disease(CD); cytokine; flow cytometry ; children

2016-11-10

温州市科技局资助项目(Y20120085)

卢华君(1977—)，男，主治医师，硕士，主要从事儿童消化道疾病的研究。

黄开宇，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.08.007

R725.7

A

1673-5293(2017)08-0913-03