芪药消渴胶囊质量标准研究

张国跃

（陕西省食品药品检验所，陕西 西安 710065）

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芪药消渴胶囊质量标准研究

张国跃

（陕西省食品药品检验所，陕西 西安 710065）

目的 建立芪药消渴胶囊的质量控制方法。方法 采用薄层色谱（TLC）法对制剂中的黄芪、葛根、知母进行定性。采用反相高效液相色谱（RP－HPLC）法对制剂中的西洋参进行定量，色谱柱为Ultimate C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，流动相为乙腈－0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，流速为1.0 mL／min，柱温为40℃，检测波长为203 nm。结果 TLC法定性斑点清晰，分离度好。RP－HPLC法测定Rg1，Re和Rb1对照品进样量分别在0.985 9～14.788 5 mg，0.411 6～4.939 2 mg和0.132 3～1.984 5 mg范围内与峰面积线性关系良好，回收率分别为95.19%，97.84%，103.65%，RSD分别为2.29%，2.97%，3.87%（n＝6）。结论 该定性、定量方法操作简便、准确、重复性好，可有效地控制该产品质量。

芪药消渴胶囊；黄芪；葛根；知母；西洋参；薄层色谱法；反相高效液相色谱法

芪药消渴胶囊由西洋参、黄芪、知母、五味子、五倍子、葛根等12味中药组方，具有滋肾养阴、益气生津的功效，临床常用于2型糖尿病的辅助治疗。原质量标准收载于国家食品药品监督管理局标准YBZ25672005中，检验项目较少，不能全面控制产品质量。受陕西康惠制药股份有限公司的委托，按照国家药典委员会关于药品质量标准技术要求和对该品种补充资料通知[国药典中行字（2014）补329号）]的要求，对“芪药消渴胶囊”原质量标准中的【性状】项、【鉴别】项、【浸出物】项及【检查】项“人参”的薄层色谱检查方法，进行了全面修订和验证，建立了西洋参的含量测定方法，并进行了方法学验证，最终确定了黄芪、葛根、知母、西洋参、山药和枸杞子的定性、人参的检查及西洋参的定量方法。本研究中介绍了黄芪、葛根、知母的薄层色谱（TLC）定性法和测定西洋参中人参皂苷Rb1，Re，Rg1含量的反相高效液相色谱（RP－HPLC）法。本次修订的质量标准定性方法简便易行、准确可靠、重复性好，可全面、有效地控制该产品质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LG－30AD型高效液相色谱仪（紫外检测器，日本岛津公司）；LG－20AD型高效液相色谱仪（二极管阵列检测器，日本岛津公司）；Waters Empower工作站（美国Waters公司）；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料(Kromasil公司，250 mm×4.6 mm，5 μm；Ultimate公司，250 mm×4.6 mm，5 μm)；SartoriusAGME235S型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；UV2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；KQ－500DE型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

芪药消渴胶囊样品，西洋参药材，黄芪、葛根、知母、西洋参等阴性样品均由陕西康惠制药股份有限公司提供；葛根（批号为 1175－200001）、知母（批号为121070－201105）、西洋参（批号为120997－200608）对照药材，黄芪甲苷（批号为110781－200512）、葛根素（批号为110752－200511）、菝葜皂苷元（批号为110744－200509）、人参皂苷 Rg1（批号为 110703－201027）、Re（批号为 110754－201324，）和 Rb1（批号为 110704－201223）对照品均由中国食品药品检定研究院提供；试验用化学试剂为分析纯，试验用水为纯化水和超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯。预制板(青岛海洋化工厂分厂)；薄层板(青岛海洋化工有限公司)，自行铺制。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别[1－3]

黄芪：取样品胶囊，倾出内容物，精密称取4 g，放入滤纸卷内并置索氏提取器内，加入乙醚，水浴回流2 h，乙醚液弃去，挥去药渣的乙醚，再加入甲醇，水浴回流提取至无色，取甲醇液蒸干，残渣用水20 mL使其溶解，分次转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取5次（25，20，20，20，15 mL），合并正丁醇液，再用氨试液洗涤2次，每次15 mL，弃去氨试液，把正丁醇蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含黄芪的阴性样品4 g，精密称定，用相同方法制成黄芪阴性对照溶液。再取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成1 g／L的溶液，作为对照品溶液。吸取上述3种溶液各5 μL，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水（65∶35∶10，在10℃以下放置12 h使分层，取下层溶液）为展开剂，展开，取出，晾干，薄层板上喷10%硫酸乙醇溶液，用热风吹至斑点显色，在日光下和紫外光灯(365 nm)下观察。结果斑点在日光下和紫外光灯(365 nm)下均显色清晰，分离效果较好，Rf值适中，阴性对照无干扰，专属性好。详见图1A和图1B。

葛根：取样品胶囊倾出内容物，精密称取4 g，加入20 mL甲醇，超声处理10 min，将甲醇用滤纸过滤，滤液蒸干，残渣加5 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。取不含葛根的阴性样品4 g，用相同方法制成葛根阴性对照溶液。另取葛根素对照品，加甲醇制成0.5 mg／mL的溶液，作为对照品溶液。再取葛根对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水（15∶40∶22∶10，10℃以下放置12 h使分层，取下层溶液）为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光灯(365 nm)下观察。结果斑点无扩散，Rf值合适，分离效果尚好，阴性对照无干扰[3]。详见图1 C。

知母：取样品胶囊倾出内容物，精密称取4 g，加50 mL 75%乙醇溶液，加热回流40 min，滤过，滤液加盐酸2 mL，回流水解2 h，滤过，滤液浓缩至约10 mL，用二氯甲烷40 mL分2次提取，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，移入中性氧化铝柱（100～200目，4 g，内径15 mm）中，以甲醇为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液约80 mL，水浴蒸干，残渣加1 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。同法制成知母阴性对照溶液。另取菝葜皂苷元，加甲醇制成1 g／L的溶液，作为对照品溶液。再取知母对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述4种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－丙酮（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，薄层板喷磷钼酸试液，在105℃小心加热，至斑点显色清晰。结果斑点分离较好，Rf值适宜，阴性对照基本无干扰[4－5]。详见图1 D。

图1 薄层色谱鉴别图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，见表1；流速：1.0 mL／min；检测波长：203 nm；柱温：40℃。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：分别称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷 Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇使其溶解，制成混合对照品溶液，每1 mL含人参皂苷Rg10.1 mg，人参皂昔Re 0.4 mg，人参皂苷Rb11 mg，即得。

供试品溶液：取胶囊内容物，混合均匀，研细，取约3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50 mL，称定质量，置水浴中加热回流提取1.5 h，放冷，再称定质量，用水饱和正丁醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中，蒸干，残渣加50%甲醇适量使溶解，转移至10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 方法学考察

检测波长确定：取人参皂苷 Rg1对照品溶液（约0.13 g／L），在200～350 nm波长处进行紫外光谱扫描，结果人参皂苷Rg1对照品溶液的最大吸收波长在203 nm，与文献[1，6]的研究结果类似，故选择203 nm作为检测波长。

专属性试验：取不含西洋参的阴性样品，依法制备阴性对照品溶液，取适量注入高效液相色谱仪，测定，再与混合对照品溶液和供试品溶液比较。结果西洋参阴性对照在混合对照品溶液保留相同时间处未出现色谱峰，表明阴性对照品溶液对此方法无干扰，专属性强。色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图

线性关系考察：分别依法进样量1，2，3，4，5，10，15 μL人参皂苷混合对照品溶液，测定。以进样量(X)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程人参皂苷Rb1：Y＝3×10－6X－0.102（r＝0.999 6），人参皂苷Re：Y＝4×10－6X－0.085（r＝0.999 8），人参皂苷Rg1：Y＝5×10－6X－0.032（r＝0.997）。结果表明，3种对照品溶液的进样量分别在0.985 9～14.788 5 mg、0.411 6～4.939 2 mg、0.132 3～1.984 5 mg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：重复取上述对混合照品溶液7次，进样测定。结果峰面积的 RSD分别为0.37%，1.38%，1.13%(n＝7)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一份样品，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，9，24，37 h时进样测定，结果表明，供试品溶液在37 h内稳定性较好。

重复性试验：精密称取同一样品共6份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果人参皂苷Rb1平均含量为7.744 1 mg／g，RSD＝2.18%(n＝6)；人参皂苷Re平均含量为6.466 0 mg／g，RSD＝1.76%(n＝6)；人参皂苷Rg1平均含量为0.986 1 mg／g，RSD＝2.67%(n＝6)；3种人参皂苷总量为15.196 2 mg／g。表明方法重复性良好。

加样回收试验：分别精密量取含3种人参皂苷的对照品混合溶液1 mL，置具塞锥形瓶中，挥干溶剂，再精密称取样品约0.5 g，共6份，依法制备供试品溶液，进样测定，结果见表2。

光谱扫描与峰纯度检测：取供试品溶液与人参皂苷Rb1，Re，Rg1混合对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定，用二极管阵列检测器，扫描190～400 nm波长的PDA光谱并观察峰的纯度。结果供试品溶液的高效液相色谱图中分别呈现与人参皂苷Rb1，Re，rRg1对照品溶液色谱峰保留时间相同的色谱峰，PDA光谱与上述对照品溶液的PDA光谱相同，样品的峰纯度符合要求。

2.2.4 样品含量测定

按上述供试品溶液制备方法制备溶液，测定10批样品中3种人参皂苷含量的总量，结果总量为12.059 4～15.989 1 mg／g，平均含量为14.597 8 mg／g。详见表3。

表2 人参皂苷加样回收试验结果（n＝6）

表3 样品含量测定结果（mg／g，n＝4）

3 讨论

根据3批西洋参药材、10批样品中3种人参皂苷总量的含量测定结果，人参皂苷Rg1，Re，Rb1总量在本试验的转移率为100.8%，考虑到西洋参药材中待测成分的波动，同时参考2015年版《中国药典（一部）》“西洋参”药材中人参皂苷总量含量限度的规定，西洋参含量限度暂规定为：本品每粒含西洋参以人参皂苷 Rg1 (C42H72O14)、人参皂苷 Re(C48H82O8)和人参皂苷 Rb1 (C54H92O23)的总量计，不得少于4.0 mg。

根据芪药消渴胶囊的处方和制备工艺，参照2010年版《中国药典（一部）》“西洋参”含量测定方法和文献[1，6－8]，以水饱和的正丁醇为提取溶剂，分别用超声处理1 h，加热回流1，1.5，2 h制备供试品溶液，结果以加热回流1.5 h 3种人参皂苷总量的含量较高，增加回流时间制备供试品溶液，3种人参皂苷总量的含量并未明显提高。另外，通过改变试验条件考察了西洋参含量测定的耐用性，分别用0.9，1.1 mL／min的流速或以30℃，35℃柱温以及用其他品牌的C18色谱柱分别运行供试品溶液，结果待测定的色谱峰峰形、面积、分离度均无显著变化。

西洋参为五加科植物西洋参 Pawajcquinquefolium L.的干燥根。西洋参及其主要活性成分具有滋补、强壮、抗疲劳、扩血管、益智、抗癌等多种作用[9]。现代研究显示，某些人参皂苷具有治疗糖尿病的作用，能提高血清中的胰岛素水平。文献[10－13]报道，西洋参中可能含有的焦谷氨酸不但能显著地抑制肾上腺素诱导的脂肪分解，也能促进体内葡萄糖合成脂肪，从而降低血糖。张慧丽[14]从西洋参药材中检测到了焦谷氨酸，这为西洋参治疗糖尿病提供了相应的理论依据。使用中药治疗糖尿病，或者改善糖尿病患者的症状是目前的糖尿病研究热点之一[15]，贾继明等[10]综述了近年来国内外西洋参在治疗糖尿病、控制糖尿病患者血糖方面的文献报道，国外学者的大量研究表明，西洋参具有一定的降糖活性，尤其在降低2型糖尿病患者的餐后血糖方面有着明显作用。

芪药消渴胶囊是用于治疗消渴病（糖尿病）的常用中药制剂，西洋参作为芪药消渴胶囊的君药，对控制其皂苷类的含量有着重要意义。动物试验显示，芪药消渴胶囊连续给试验动物口服1周后，正常大鼠、小鼠及四氧咯吮糖尿病小鼠的血糖有了明显降低[16]，这也印证了文献[17－18]的报道。

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Quality Standard of Qiyaoxiaoke Capsule

Zhang Guoyue
(Shaanxi Institute for Food and Drug Control,Xi′an,Shaanxi,China 710065)

Objective To establish a method for quality control of Qiyaoxiaoke Capsule.M ethods The Radix Astragali,Radix Puerariae, Rhizoma Anemarrhenae in the preparation were analyzed qualitatively by TLC method,the Panax Quinquefolius in the preparation was quantified by RP－HPLC method.Ultimate C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)was adopted,acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution was the mobile phase,gradient elution,the flow rate was 1.0 mL／min,the column temperature was 40℃,the detection wavelength was 203 nm.Results TLC legal spots were clear and well separated.Rg1,Re and Rb1standard sample volume respectively in 0.985 9－14.788 5 mg,0.411 6－4.939 2 mg and 0.132 3－1.984 5 mg range showed a good linear relationship with the peak area,the recovery rates were 95.19%,97.84%,103.65%,RSD＝2.29%,2.97%,3.87%(n＝6).Conclusion The method is simple,accurate and reproducible,which can effectively control the quality of the product.

Qiyaoxiaoke Capsule;Radix Astragali;Radix Puerariae;Rhizoma Anemarrhenae;Panax Quinquefolius;TLC;RP－HPLC

R284.2

A

1006－4931(2017)15－0023－04

2017－03－06；

2017－05－10)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.15.007

张国跃（1959－），男，副主任药师，中国管理科学研究院特约研究员，主要从事药品、食品检验和中药质量标准研究工作，（电话）029－62288444（电子信箱)zgy591959＠163.com。