普通小麦春化作用研究进展

冯岳+褚蔚+樊庆琦+黄承彦+隋新霞+崔德周+楚秀生

摘要：春化是小麦品种的重要性状，直接影响着小麦品种的种植范围和利用效率。本文从小麦冬春性鉴定方法、鉴定指标、春化相关基因及分子机理等方面入手，综述了小麦冬春性的研究进展。分析比较了目前常用小麦冬春性鉴定方法并总结了依靠自然低温春化鉴定的利弊。对目前小麦春化相关基因的研究进行了总结，分析了小麦冬春性分子机理研究中存在的关键问题，提出了小麦冬春性下一步研究的重点。

关键词：普通小麦；春化鉴定；春化基因

中图分类号：S512.101 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0160-08

Abstract Vernalization is one of the important characteristics of common wheat which affects the planting area and utilization efficiency. The research progress of vernalization in common wheat was reviewed from aspects of identification methods and identification indexes of wheat springness and winterness， vernalization genes， molecular mechanism， etc. The common identification methods of wheat springness and winterness were compared， and the pros and cons of natural temperature dependent identification methods were discussed. The researches of vernalization related genes in wheat were summarized. The problems existed in the current molecular mechanism studies of wheat springness and winterness was analyzed， and the future research aspects was preliminarily discussed.

Keywords Common wheat ；Vernalization identification ；Vernalization gene

小麦春化现象是指小麦必须经历一段时间的持续低温才能由营养生长阶段转入生殖阶段生长的现象。冬春性不同的小麦品种，其抗寒性、生育期、丰产性等往往存在较大差异，因此春化作用一直是小麦育种与生理研究领域的重要课题，对其研究不但能够揭示春化发育的生理机制和分子机理，补充完善春化作用的理论，更重要的是可为培育抗寒、广适、高产的小麦品种提供理论依据。本文就小麦冬春性的鉴定方法、生理指标、生理生化及分子机制方面的研究成果进行综述，旨在为今后小麦冬春性研究提供参考。

1 冬春性的定义及分类

“春化”一词最早是由前苏联学者李森科（Lysenko）提出[1]，是指小麦在人为冷处理状态下获得的加速抽穗开花的现象。冬小麦品种在其营养生长期需要经历一定时间的低温阶段（如冬季），获得足够的累积低温，才能正常抽穗开花结实，目前一般将这种低温积累过程对小麦正常抽穗开花的作用称之为春化作用。根据春化特点，习惯上将小麦品种划分为三种类型：冬性、半冬性和春性。不同冬春性品种对低温持续时间和温度需求不同：冬性品种在0～7℃下30 d以上即可通过春化，冬性特别强的品种则要40 d以上；半冬性品种通过春化需要在3～15℃持续20～30 d；春性品种原则上不需要春化即可正常抽穗开花[2]。未通过春化的品种，植株维持在营养生长阶段，或营养生长转为生殖生长的时间大大延迟，表现为无效分蘖增多、抽穗期延迟或抽穗不完全、熟期推迟等。尽管如此，只要给予足够长的时间，即使未进行春化处理，也能最终抽穗。

2 小麦冬春性的鉴定方法

2.1 国外小麦冬春性鉴定方法

关于小麦冬春性划分的标准，国内外略有差异。国外研究者通常利用温室的方法判定冬春性。即在温室条件下播种，温度保持在15℃以上，光照长度一般在16～20 h或更长（满足光周期需求），以达到一定时间临界点时材料是否抽穗或旗叶出现时间或最终叶片数等指标作为判定的标准[3-7]。例如，Beales等[7]在20℃和每天光照16 h条件下，以60 d和107 d作为时间临界点，60 d以前抽穗的品种划分为春性品种，107 d以后抽穗的品种划分为冬性品种，但他的研究在60 d和107 d之间未发现抽穗品种。

2.2 国内小麦冬春性鉴定方法

2.2.1 常规田间鉴定法 常规田间鉴定首先是对小麦幼苗习性的观察，一般认为，冬性小麦幼苗习性为半匍匐，春性小麦多为直立。其次，从起身、拔节、抽穗和开花时间来看，春性小麦往往较冬性小麦早[8]。另外，通过观测小麦在北方春播、秋播和在南方冬播的抽穗情况，对照标准品种，也可以把小麦冬春性进行分类，即：在北方春播和南方冬播不能抽穗为冬性；在北方春播和南方冬播部分植株抽穗，且不整齐为半冬性；在北方春播和南方冬播能正常抽穗成熟为春性[9]。但常规田间鉴定法缺乏详细的鉴定标准，准确性差且工作量大。

2.2.2 综合顺序分类法 针对常规田间鉴定法中存在的不足，张灿军[10]通过多年试验总结，提出综合顺序分类法进行小麦冬春性鉴定，即在平均气温达到3℃、7℃和10℃时进行错期播种，通过调查播种期、出苗期、幼苗习性、基本苗数、最高总茎数、始穗期、抽穗期、抽穗数、成熟期等数据，确定小麦冬春性。分级标准为：春季平均气温7℃时播种，抽穗率>30%且能正常成熟为春性，抽穗率≤30%且不能正常成熟为冬性；春季平均气温3℃条件下播种，以抽穗率0、5%和20%划分强冬性、冬性、弱冬性和半冬性；春季平均气温10℃条件下播种，以抽穗率30%和60%划分弱春性、春性和强春性。综合顺序分类法是目前国内应用较为广泛的小麦冬春性鉴定方法，已作为国家标准发布。但综合顺序分类法的不足之处在于：低温春化过程依賴自然气候条件，但不同地区、不同年份之间温度变化、气温回升速度和温度波动存在较大差异，分期播种的适宜播种时间很难掌握；依靠往年气候经验来确定播种时间，难以对不同春化习性品种所需的温度临界点和春化积温进行准确划分；且鉴定过程易受到极端气候等自然因素的干扰。因此综合顺序分类法需要进行多年多地的试验才能得到更加准确的鉴定结果。endprint

3 春化基因

截至目前的研究，已知4个基因与小麦春化反应有关，分别被命名为Vrn-1、Vrn-2、Vrn-3和Vrn-4。Vrn-1位于小麦的A、B和D染色体组的第5染色体长臂上，分别命名为Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1[11-26]；Vrn-2位于5A染色体上[26]；Vrn-3位于7BS染色体长臂上，其候选基因命名为TaFT1[19]；Vrn-4被定位于六倍体小麦5D染色体靠近着丝粒的位置[27]。

3.1 Vrn-1基因

Vrn-1基因编码API基因家族的MADS-box转录因子，该转录因子与拟南芥中的分生组织特性基因APETALA1、CAULI-FLOWER和FRUITFULL有高度相似性，调控分生组织由营养生长向生殖生长的转变[6，20，22，29]。Vrn-1基因分为显性和隐性两种类型，显性基因对应春性，隐性基因对应冬性。与隐性等位基因相比，Vrn-1显性等位基因的启动子区出现了插入或缺失序列。显性基因是可被抑制的，一些转录因子可结合于该基因启动子的CArG-box区域[30]，或者结合在第1内含子长436 bp碱基的“春化决定区域”[31]。隐性基因是不能被抑制的，因为该基因的CArG区域和“春化决定区域”均被删除，转录因子无法与其结合。Loukoianov等[30]利用近等基因系TDD、TDB、TDE和TDC对六倍体小麦不同基因组间Vrn-1的基因效应做了研究，结果显示Vrn-A1的春化作用最强，且对Vrn-B1和Vrn-D1有上位性效应，而Vrn-B1和Vrn-D1对春化效应的敏感性较弱，且Vrn-B1对小麦开花的促进作用强于Vrn-D1[32]。

在普通小麦中，Vrn-A1位点目前已发现多种显性基因等位变异类型。显性等位基因Vrn-A1启动子区插入131与43或222 bp碱基等位变异类型，定名为Vrn-A1a显性类型；Maquis等品种的启动子区缺失20 bp碱基，该等位变异类型定名为Vrn-A1b；六倍体阿富汗地方品种IL369 在启动子区不存在插入或缺失突变，与隐性等位基因vrn-A1序列相同，该显性等位变异类型定名为显性Vrn-A1c。在3个T. turgidum ssp. dicoccoides材料中，启动子序列区缺失32 bp碱基，确定为显性Vrn-A1d类型；在Triticum turgidum ssp. dicoccum材料ST27存在54 bp碱基，确定为显性Vrn-A1e等位变异类型。在Vrn-A1基因启动子区，含显性等位基因的四倍体品种Langdon和六倍体地方品种IL369与隐性等位基因序列相同，没有差异[33]。

Vrn-B1基因也发现有3种显性等位变异类型：Vrn-B1a、Vrn-B1b和Vrn-B1c[34]。与隐性等位基因vrn-B相比，显性等位基因VRN-B1a在第一内含子中缺失一段6 850 bp的片段；VRN-B1b除了在第一内含子中缺失6 850 bp的片段外，还有一段36 bp的小片段缺失和一个单核苷酸的突变[34]；Vrn-B1c在第1内含子区域除7 228 bp碱基的缺失外，还有267 bp碱基的重复[35]。

Vrn-D1位点截至目前共发现了2个显性等位变异，分别为VRN-D1a和VRN-D1b。VRN-D1a在隐性等位基因vrn-D1的第一内含子中发生了4 235 bp的缺失[26]，而VRN-D1b在VRN-D1a的基礎上，还在翻译起始位点ATG的上游161 bp处出现了单核苷酸的突变，由胞嘧啶C突变为腺嘌呤A[26，36]。当VRN-A1和VRN-B1位点的等位基因都为隐性时，纯合vrn-D1的小麦表现为冬性，纯合VRN-D1b的植株表现为半冬性，而纯合VRN-D1a表现为春性。Zhang等[36]通过对VRN-D1a和VRN-D1b的F2群体研究发现，纯合体VRN-D1a的抽穗期较纯合体VRN-D1b早32天，且植株个体叶片数多。这表明VRN-D1b需要较强的春化作用。类似于VRN-D1这种三种等位变异导致三种渐变的春化类型的现象并未在VRN-A1和VRN-B1中发现。Kiss等[37]在研究VRN1基因在世界小麦分布时发现，美洲小麦主要含有 Vrn-A1 和 Vrn-B1；而亚洲小麦以含有显性 Vrn-D1 为主要特点。Kamran等[38]建议在育种中通过将VRN-D1引入春小麦中来缩短生育期、提高产量。

肖军等[39]对低温信号传递的研究发现，凝集素蛋白VER2可以通过与Vrn1抑制蛋白TaGRP2结合从而降低TaGRP2蛋白对Vrn1的抑制作用，促进Vrn1基因表达上调进而影响春化作用。另外，冬性品种虽然Vrn1基因均为隐性，但春化时间的长短也存在差异，可能是由于显性Vrn1基因对于隐性Vrn1基因并非完全显性[40]，也可能是隐性Vrn1基因存在等位变异[41]。

3.2 VRN2基因

VRN2为开花抑制基因，其表达水平受低温春化和光照影响。在四倍体小麦中，Vrn-B2具备功能，而Vrn-A2不具备功能。大麦中，该位点有3个紧密连锁的基因组成，分别命名为ZCCT-Ha、ZCCT-Hb和ZCCT-Hc；一粒小麦中有2个紧密连锁的基因组成，分别命名为ZCCT-1和ZCCT-2，两个基因有76%的序列一致性，均包含一个锌指结构域和CCT功能域。所有这些基因均编码ZCCT转录因子。这些转录因子都有2个非常重要的结构域：一是C2H2（2个半胱氨酸和2个组氨酸）结构域，由第1外显子编码，既可以与DNA结合，也可以与蛋白质结合；二是CCT结构域，CCT是由43个氨基酸组成的相当保守的结构域，由第2外显子编码，既可以控制转录因子在细胞核内的位置，也可以与CCAAT-box绑定因子结合[40]。Yan等[25]在冬性小麦P12722561和春性小麦DV92上的研究发现，两品种ZCCT1启动子区域没有差异，但在ZCCT1编码区有差异，春性品种在CCT区域35位点由精氨酸变为色氨酸，在其它70多个品种上进一步分析发现，所有35位点发生R/W突变的或者ZCCT1/ZCCT2有缺失的均表现为春性；反之则表现为冬性。所有冬性二倍体小麦中至少会含有一个有功能的ZCCT1基因；含有杂合VRN2基因的二倍体小麦只要有一个ZCCT1基因就足以使小麦表现为冬性；只有纯合的隐性vrn2基因才能使小麦表现为春性。若缺失VRN2基因，但在长日照条件下即使没有经历春化也可以促进花序的形成和发育。Vrn-2位点基因也存在显隐性之分，显性基因是具备功能，对应冬性；隐性基因则丧失了功能，对应春性。该隐性基因存在2个等位变异（vrn-2a和vrn-2b）。vrn-2a由点突变导致了功能的丧失，vrn-2b则是该基因完全被删除[25]。Vrn-2位点是目前已知的春化基因位点中，唯一一个抑制开花的基因。Dubcovsky等[21]研究表明，VRN2基因的表达量受日照长短的影响，短日照条件下，VRN2基因的表达受抑制。endprint

3.3 VRN3基因

Yan等[19]研究发现小麦Vrn-3基因与拟南芥FT基因（FLOWER LOCUS T基因，为调控开花的下游基因，编码20 kD的球状蛋白即开花素蛋白[41，42]）序列高度相似，因此小麦的Vrn-3基因也被叫做WFT[43]。VRN3基因受春化和长日照的调节进而对促进小麦开花起重要调控作用[44]。在VRN-B3位点有一个显性等位变异，该变异与小麦的春性生长习性相关。Chen等[45]在显性VRN-B3位点发现了2个新的等位变异，VRN-B3b和VRN-B3c。其中VRN-B3b在5′UTR处插入了890 bp片段，VRN-B3c除在5′UTR处插入5 300 bp片段外，还发生了2个小片段缺失。Bonnin等[46]在六倍体小麦A、D基因组上定位到与FT同源的基因VRN-A3和VRN-D3，但其作用机制未见报道。Yan等[19]发现，在VRN3起始密码子上游591 bp处插入5 295 bp的重复序列，会使得改造型中国春（CSHope 7B）比普通中国春（CS）提前开花，但在其它小麦品种中未发现该插入片段。Bonnin等[46]对不同地理起源的239种小麦品系A、D组上的VRN3基因进行了核苷酸多态性研究，表明VRN3的核苷酸多态性与植物开花的起始时间差异有关。另有研究表明，在小麦中Vrn-3蛋白与转录因子FDL2互作，FDL2可以通过与Vrn-1基因的启动子结合从而促进Vrn-1基因的表达进而促进植株开花[47]，而且，该显性基因可以在短日照条件加速开花进程[19]。

3.4 VRN4基因

Yoshida等[51]在小麦中发现了Vrn4基因，该基因位于小麦5D染色体的着丝粒位置，定位的区间长度为0.09 cM，显性的VRN4对小麦开花有促进作用[27]。比较研究发现，VRN-D4与VRN-B1和VRN-D1作用相似[49，50]；但当春化时间较短时，携带VRN-B1和VRN-D1开花时间会提前5～10 d，而纯合VRN-D4的植株则不会提前开花[51]。Kippes等[48]研究认为，VRN-D4可能位于VRN1、VRN2和VRN3组成的反馈调节环的上游，也可能是反馈调节环的组成部分。

4 春化基因间的互作

基于目前对3个位点基因（Vrn1、Vrn2和Vrn3）的研究，Pidal等[52]认为它们之间的相互作用形成了一个反馈调节环。春化之前，Vrn1和Vrn3基因的表达受Vrn2基因的抑制[27]。在春化过程中，Vrn1基因的表达活性上调，同时伴随Vrn2基因的表达活性下调，这时，Vrn1基因又可以抑制Vrn2基因的表达。随着春化过程中低温的持续积累，Vrn2基因对其它2个基因的抑制彻底消除，Vrn3基因的表达加速Vrn1基因的表达至诱导开花需求的临界点[40，54]。隐性的vrn2基因可以消除VRN1和VRN3等位基因差异对小麦开花时间的影响[53，55]，同样，当VRN1和VRN3基因为显性时，VRN2等位基因差异对开花时间的影响也会降低或消除[45]。Distelfeld等[55]认为，VRN3基因整合光周期和春化途径及其它环境因子对开花的调控，在秋天长日照条件下种子发芽后VRN3基因受到高水平表达VRN2基因的抑制而不表达，从而阻止了VRN3基因对VRN1基因的诱导，VRN1基因表达量不足，植株不能进入生殖生长；冬天来临后低温春化过程使得VRN1基因表达水平逐渐提高进而抑制VRN2基因的表达，VRN2基因表达受抑制后解除了其对VRN3基因的抑制作用，次年春天被解除抑制作用的VRN3基因在长日照条件的诱导下表达量提高从而进一步促进VRN1基因的表达，超过植株开花所需要的临界值后诱导开花。3个春化基因位点都存在许多的等位变异类型，这些基因的不同组合，可能导致了冬性与春性品种之间的多种低温需求差异。另外，张晓科[31]利用已开发的Vrn1和Vrn3春化基因的分子标记对我国小麦种质进行分子标记检测，发现个别材料分子检测结果与田间表型并不完全一致。究其原因，一是可能还存在未发现的影响春化的其它基因以及某些基因的作用机制尚不清楚（如：Vrn4）；二是光周期基因的表达也同样影响小麦的开花过程，并且Vrn2和Vrn3位点基因同时也受光照长度的调节（Vrn2受短日照调节，Vrn3受长日照调节）。

近年来的研究结果表明，植物中存在一个复杂基因网络，对春化作用的时期、强度和效果起着精细调控作用[56，57]。对拟南芥不同生态型和突变体的研究表明，基因FLOWERINGLOCUSC（FLC）可能是春化反应的关键基因，FLC基因对植物开花有抑制作用[62，63]。FLC编码的MADS-box转录因子含有7个外显子和6个内含子，通过抑制FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1）的表达实现对植物开花时间的控制[60-63]。表观遗传学的研究表明，春化的低温作用可以引起相关基因的去甲基化[64]，进而消除FLC对开花的抑制，解除赤霉素合成途径的封鎖而促进植物开花，在冬小麦中亦可很大程度上代替春化而引起植物开花，vrn1突变体使用赤霉素处理后并未对开花产生影响[59]。同样，非编码RNA也会参与FLC在春化中的表观遗传学抑制，包括FLC的反向转录本、内含子上的非编码RNA以及反向转录本启动子区域的短RNA[65-67]。例如在拟南芥中，非编码RNA COOLAIR（cold induced long antisense intragenic RNA）作为FLC基因的反向转录本，通过与FLC的mRNA片段反向互补干扰FLC基因的作用；由FLC基因第一内含子转录的非编码RNA COLDAIR（cold assisted intronic noncoding RNA）也同样对FLC基因起抑制作用[65，67]。

5 春化作用、抗寒性之间的关系endprint

小麦的抗寒性与冬春性是两个有所关联但无必然联系的生物学性状[9]。小麦抗寒性是典型的数量性状，目前研究表明，小麦中有15条染色体与抗寒性相关，其中位于第5条同源染色体长臂上的FR1被认为是抗寒的关键基因[68，69]，而FR1与VRN1在5号染色体上的位置重叠，因此VRN1基因和FR1基因是紧密连锁[70，71]还是一因多效[70，72]，意见仍不一致。Limin等[73]利用近等基因系的研究结果显示，含VRN1的春性材料比vrn1的冬性材料抗寒性低11℃。Koemel等[74]研究表明，VRN1基因的表达水平与小麦的抗寒性呈负相关。Dhillon等[72]对突变体材料的研究认为VRN-1的突变可以造成抗寒性的差异。孙果忠等[28]研究认为，携带隐性vrn1基因的位点越多，品种抗寒性越强。游光霞等[75]研究认为，地理来源相同时，品种的耐寒性一般随着VRN-1等位基因控制的春化效应的增强而减弱；当VRN-1等位基因组成相同时，品种的耐寒性一般随着地理来源的纬度降低而减弱。总之，冬春性与耐寒性之间在分子遗传调控方面的相互作用机制尚需深入探讨。

6 展望

截至目前，虽然对小麦春化机制进行了大量研究，但一些问题仍然悬而未决，例如春化基因明确而详细的调控机理还有待进一步研究；冬性的强弱受哪些基因調控还未准确界定；VRN-4基因在春化中的作用及其与其它春化基因之间的关系还缺乏深入研究等。在蛋白质组学和RNA方面对春化的研究鲜有报道，随着测序技术的发展，今后当从蛋白质和RNA方面入手进一步对春化机理进行研究。春化是小麦尤其是冬小麦开花诱导的必要条件，阐明春化作用机制对成花的调控有重要意义，对小麦引种育种有重要而深远的意义。

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