HPLC法同时测定云连药材中6种生物碱的含量Δ

潘 正，高运玲，江 生，范 刚，张 艺，曹纬国（.重庆医科大学中医药学院，重庆 0006；.重庆邮电大学生物学院，重庆 00065；.重庆市食品药品检验所，重庆 0；.成都中医药大学民族药学院，成都60）

HPLC法同时测定云连药材中6种生物碱的含量Δ

潘 正1＊，高运玲2，江 生3，范 刚4，张 艺4，曹纬国1（1.重庆医科大学中医药学院，重庆 400016；2.重庆邮电大学生物学院，重庆 400065；3.重庆市食品药品检验所，重庆 401121；4.成都中医药大学民族药学院，成都611130）

目的：建立同时测定云连药材中6种生物碱含量的方法。方法：色谱柱为XtimateTMC18，流动相为30 mmol/L碳酸氢铵溶液（含0.1%三乙胺和0.7%氨水）-乙腈（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为270 nm，柱温为30℃，进样量为10 μL。结果：药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的检测质量浓度线性范围分别为0.85～16.96 mg/L（r＝0.999 9）、1.25～24.96 mg/L（r＝0.999 8）、2.05～40.96 mg/L（r＝0.999 9）、3.65～72.96 mg/L（r＝0.999 9）、2.88～57.60 mg/L（r＝0.999 9）、13.25～264.96 mg/L（r＝0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜3.0%；加样回收率分别为97.14%～102.14%（RSD＝1.93%，n＝6）、97.00%～102.00%（RSD＝2.06%，n＝6）、98.18%～101.82%（RSD＝1.79%，n＝6）、96.15%～101.28%（RSD＝2.06%，n＝6）、96.88%～101.88%（RSD＝1.87%，n＝6）、99.31%～103.76%（RSD＝1.89%，n＝6）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于云连药材中6种生物碱含量的同时测定。

云连；生物碱；含量测定；高效液相色谱法

黄连是中医临床常用药物，始载于《神农本草经》，药用历史悠久。黄连味苦，性寒，归心、肝、胃、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，临床上常用于治疗湿热痞满、呕吐、心火亢盛、黄疸、消渴、牙痛、痈肿疗疮等症[1]。现代药理研究表明，黄连具有抗病原微生物、抗炎、抗癌、抗溃疡、降血糖、解热和保肝等作用[2]。2015年版《中国药典》（一部）记载黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连C.deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao或云连C.teeta Wall.的干燥根茎，药材依次习称为“味连”“雅连”和“云连”。

有文献检测了不同产地和品种黄连药材中的总生物碱，发现云连中的总生物碱高于味连和雅连[3]；有研究检测了不同产地和品种黄连中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和药根碱的含量，却发现云连中上述3种生物碱含量低于味连，由于该研究收集云连样品均未超过3批，样品量较少[4]；同时，云连中除了上述3种生物碱外，黄连碱、表小檗碱和非洲防己碱也是其主要成分。鉴于上述原因，笔者采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定了8批云连药材中上述6种生物碱的含量，以期为云连药材的质量控制与评价及其临床合理利用提供一定借鉴。

1 材料

1.1 仪器

1200型HPLC仪，包括DAD检测器（美国Agilent公司）；CPX8800H-C型超声波清洗器（上海必能信有限公司）；BP121S型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

盐酸小檗碱、盐酸巴马汀对照品（批号分别为110713-200609、110732-200506）均购自中国食品药品检定研究院；黄连碱、非洲防己碱、表小檗碱、药根碱对照品（批号分别为 20100501、20100502、20100701、20110406）均由重庆市中药研究院提供，以上对照品纯度均＞98%；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

笔者共收集云连药材8批（见表1），经重庆医科大学中医药学院王刚副教授鉴定为真品。

表1 云连药材来源Tab 1 Source of C.teeta

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：XtimateTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：30 mmol/L碳酸氢铵溶液（A，含0.1%三乙胺和0.7%氨水）-乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，10%→25% B；15～25 min，25%→30%B；25～40 min，30%→45% B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，理论板数以药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰计＞3 000；各成分基线分离良好，分离度＞1.5，详见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取待测成分对照品适量，加盐酸-甲醇（1∶100，V/V）制成药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱质量浓度分别为16.96、24.96、40.96、72.96、57.60、264.96 mg/L的混合对照品溶液。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.2 供试品溶液 取药材样品粉末约0.1 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（1∶100，V/V）50 mL，密塞，称定质量，超声（功率：240 W，频率：45 kHz，下同）处理30 min，取出，放冷，再次称定质量，用盐酸-甲醇（1∶100，V/V）补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.5、1、2、5、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加盐酸-甲醇（1∶100，V/V）定容，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，mg/L）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程与线性范围，详见表2。

表2 回归方程与线性范围Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.4 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为1.52%、1.31%、1.47%、1.75%、1.63%、1.97%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（No.5）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为1.64%、1.22%、2.04%、1.46%、0.88%、1.74%（n＝6），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

2.6 重复性试验

精密称取同一批样品（No.5）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为1.36%、1.72%、0.93%、2.16%、2.33%、1.61%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取已知含量样品（No.5）适量，共6份，分别加入一定质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

续表3Continued tab 3

2.8 药材样品含量测定

取8批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4（表中“-”为含量＜0.01%而未检出）。

表4 药材样品含量测定结果（n＝3，%）Tab 4 Result of contents determination of samples（n＝3，%）

3 讨论

笔者参考有关文献[4-6]，考察了50 mmol/L磷酸二氢钾-甲醇、50 mmol/L磷酸二氢钾（加入不同浓度的十二烷基磺酸钠）-乙腈溶液、0.1%三氟乙酸-乙腈、30 mmol/L碳酸氢铵溶液-乙腈等流动相体系，结果表明，30 mmol/L碳酸氢铵溶液-乙腈能较好地分离6种生物碱，并在水相中加入一定浓度的三乙胺和氨水调pH后，能明显改善色谱峰的对称性。因此，最终确定最佳的流动相为30 mmol/L碳酸氢铵溶液（含0.1%三乙胺和0.7%氨水）-乙腈，进行梯度洗脱。此外，在供试品溶液的制备中，本研究对提取方法（超声、回流）、提取溶剂（甲醇、乙醇、盐酸-甲醇、盐酸-乙醇）、提取时间（30、40、50 min）及提取溶剂用量（40、50、60 mL）等因素进行了考察，最终发现以盐酸-甲醇（1∶100，V/V）50 mL超声提取30 min的提取效果最佳。

笔者同时测定云连药材中6种生物碱，结果云连药材中6种生物碱的平均含量高低依次为：盐酸小檗碱＞黄连碱＞药根碱＞盐酸巴马汀＞非洲防己碱＞表小檗碱。本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于云连药材中6种生物碱含量的同时测定。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：303-305.

[2] Tang J，Feng YB，Tsao S，et al.Berberine and Coptidis Rhizoma as novel antineoplastic agents：a review of traditional use and biomedical investigations[J].J Ethnopharmacol，2009，126（1）：5-17.

[3] 张德伟，封海霞，熊学庆，等.不同商品来源云南黄连中重金属含量的测定与评价[J].中国药业，2016，25（4）：79-81.

[4] 晁若冰，张浩，庄燕黎，等.高效液相色谱法测定黄连药材中小檗碱型生物碱的含量[J].药物分析杂志，2003，23（5）：354-357.

[5] 赖先荣，周邦华，杜明胜，等.6种黄连饮片中6种生物碱的RP-HPLC含量测定及与“治消渴”药效学的谱-效关系分析[J].中国中药杂志，2016，40（24）：4579-4586.

[6] 阳勇，李铁，朱晶晶，等.HPLC法测定黄连药材及其炮制品中主要生物碱的含量[J].中成药，2010，32（9）：1540-1544.

Simultaneous Determination of 6 Alkaloids in Coptis teeta by HPLC

PAN Zheng1，GAO Yunling2，JIANG Sheng3，FAN Gang4，ZHANG Yi4，CAO Weiguo1（1.College of TCM，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.College of Biology，Chongqing University of Posts and Telecommunication，Chongqing 400065，China；3.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China；4.College of Ethnic Medicine，Chengdu University of TCM，Chengdu 611130，China）

Coptis teeta；Alkaloids；Content determination；HPLC

R917

A

1001-0408（2017）24-3408-04

2016-12-05

2017-01-14）

（编辑：张 静）

重庆市基础与前沿研究计划项目（No.cstc2014jcyj A10004）；重庆市教委科学技术研究项目（No.KJ1400433）；重庆市卫生计生委中医药科技项目（No.ZY201602066）

＊副教授，博士。研究方向：中药化学成分分析。电话：023-65712062。E-mail：letter2013@sina.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.28

ABSTRACTOBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determination of 6 alkaloids in Coptis teeta.METHODS：The determination was performed on XtimateTMC18with mobile phase consisted of 30 mmol/L ammonium bicarbonate[containing 0.1% triethylamine and 0.7%ammonia-acetonitrile（gradient elution）]at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 270 nm，the column temperature was 30℃，and the sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of jateorrhizine，columbamine，epiberberine，coptisine，palmatine hydrochloride and berberine hydrochloride were 0.85-16.96 mg/L（r＝0.999 9），1.25-24.96 mg/L（r＝0.999 8），2.05-40.96 mg/L（r＝0.999 9），3.65-72.96 mg/L（r＝0.999 9），2.88-57.60 mg/L（r＝0.999 9）and 13.25-264.96 mg/L（r＝0.999 9），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%.Recoveries were 97.14%-102.14%（RSD＝1.93%，n＝6），97.00%-102.00%（RSD＝2.06%，n＝6），98.18%-101.82%（RSD＝1.79%，n＝6），96.15%-101.28%（RSD＝2.06%，n＝6），96.88%-101.88%（RSD＝1.87%，n＝6），99.31%-103.76%（RSD＝1.89%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，stability and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 6 alkaloids in Coptis teeta.