解淀粉芽胞杆菌TF28产抗菌脂肽培养基优化

刘宇帅, 孟利强, 陈静宇, 姜 威, 曹 旭,胡基华, 李 晶, 张淑梅*

(1.黑龙江省科学院 微生物研究所，黑龙江 哈尔滨 150010； 2.黑龙江省科学院 高技术研究院，黑龙江 哈尔滨 150020)

解淀粉芽胞杆菌TF28产抗菌脂肽培养基优化

刘宇帅1,2, 孟利强1,2, 陈静宇1, 姜 威1,2, 曹 旭1,2,胡基华1, 李 晶1,2, 张淑梅1,2*

(1.黑龙江省科学院 微生物研究所，黑龙江 哈尔滨 150010； 2.黑龙江省科学院 高技术研究院，黑龙江 哈尔滨 150020)

采用响应面方法对解淀粉芽胞杆菌TF28产抗菌脂肽培养基进行优化，以提高其产量。利用Plackett-Burman试验设计筛选出影响抗菌脂肽产量的3个主要因素：葡萄糖、硫酸镁和磷酸氢二钠。通过最陡爬坡试验逼近最大响应值区域，利用响应面分析方法确定显著组份的最佳水平。结果表明，优化后的培养基组份为葡萄糖42.37 g/L，酵母膏2 g/L，牛肉膏2 g/L，硫酸铵2 g/L，硫酸镁2.11 g/L，氯化钙0.1 g/L，硫酸锰0.1 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，磷酸氢二钠 3 g/L，经3次平行试验验证，抗菌脂肽产量为1.75 g/L，比优化前提高了5.25倍。该研究优化了解淀粉芽胞杆菌TF28提高抗菌脂肽产量的培养基，为抗菌脂肽的生产奠定基础。

解淀粉芽胞杆菌；抗菌脂肽；培养基优化

农业双减计划的实施为新型生物农药的研发注入了新的活力。解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens在自然界中分布广泛，能够产生抗逆胞子和脂肽类、肽类和蛋白类等多种抗菌物质，是一类具有较高开发价值的农用微生物[1-3]。Surfactin、Iturin和Fengycin是解淀粉芽胞杆菌产生的主要环状脂肽类抗菌物质，其结构多样，具有广谱抑菌活性和稳定性，参与生防菌根际定殖、拮抗病原菌和诱导植物系统抗性等多种生防过程，在植物病害防控方面具有应用前景[4-6]。抗菌脂肽的生物合成受多种因素影响，其中培养基组份是影响抗菌脂肽产量的主要因素[7]。研究表明，碳氮源是合成抗菌脂肽必备营养成分，不同菌株所需碳氮源的种类不同[8]。解淀粉芽胞杆菌Q-426能够利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油和山梨醇等多种碳源，胰蛋白胨、L-组氨酸和赖氨酸3种氮源产生抗菌脂肽，葡萄糖和胰蛋白胨是优选碳氮源[7]；解淀粉芽胞杆菌ES-2能够利用葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖4种碳源，牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸钠、L-谷氨酸等多种氮源产生抗菌脂肽，葡萄糖和L-谷氨酸是优选碳氮源[9]。除碳氮源外，某些金属离子影响抗菌脂肽的产量，Wei等[10-11]报道适量的Fe2+和Mn2+能显著提高芽胞杆菌抗菌脂肽产量。解淀粉芽胞杆菌产生的抗菌脂肽种类和产量因菌株而异，有些菌株能够产生多种抗菌脂肽，而且每种含有多个同系物，这些脂肽协同作用使菌株呈现抗菌活性[12-13]。BacillusamyloliquefaciensTF28是一株分离自大豆根部的内生细菌，具有广谱抑菌活性，前期研究发现该菌株能够分泌抑制植物病原真菌的抗菌脂肽[14]，但是产量较低，难以应用。本研究采用响应面方法从碳氮源和无机盐方面对菌株TF28产抗菌脂肽培养基进行优化，为提高菌株抑菌活性及抗菌脂肽的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 生防细菌解淀粉芽胞杆菌BacillusamyloliquefaciensTF28和病原真菌黄瓜枯萎病菌 (Fusariumoxysporum)均为本实验室分离保存。

1.1.2 培养基(g/L) LB培养基：酵母膏5，蛋白胨10，NaCl 10，初始pH 7.2;NYD培养基：牛肉膏8，酵母膏5，葡萄糖5，初始pH 7.2;基础发酵培养基A：葡萄糖20，牛肉膏2，酵母膏2，硫酸锰0.1，氯化钙0.1，硫酸铵2，硫酸镁0.2，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钠1，初始pH 7.2～7.5;PDA培养基：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂粉150。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 低温保藏的TF28菌株依次用LB平板和试管活化后，接种于装有50 mL NYD的250 mL三角瓶中，30 ℃、170 r/min 培养18 h，制备种子液，按2%接种量转接于发酵培养基中，30 ℃、170 r/min 培养48 h，于提取脂肽类抗菌物质。黄瓜枯萎病菌用PDA培养基于26 ℃培养7 d，无菌水洗脱孢子制备孢子悬浮液，浓度为106cfu/mL。

1.2.2 抗菌脂肽提取 培养48 h的发酵液4 ℃、10 000 r/min离心15 min，去除菌体，加浓盐酸于上清液中至pH 2.0，4 ℃静置过夜后，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，收集沉淀，自然干燥后称重，用甲醇溶解备用[15]。

1.2.3 抑菌活性测定 以黄瓜枯萎病菌为指示菌，采用抑菌圈方法测定抗菌脂肽抑菌活性。取100 μL胞子悬液涂布PDA平板，放入灭菌钢圈，将抗菌脂肽滴入钢圈中，26 ℃温箱培养3 d，测定抑菌圈大小，以甲醇做对照。

1.2.4 基础发酵培养基筛选 将种子液按2%接种量分别接种于50 mL的LB、NYD 和A培养液中，30 ℃、170 r/min 培养48 h，收集发酵液，按上述方法制备抗菌脂肽，称重后测定抑菌活性。

1.2.5 Plackett-Burman试验设计 通过预实验确定基础培养基组份为葡萄糖20 g/L，牛肉膏2 g/L，酵母膏2 g/L，硫酸锰0.1 g/L，氯化钙0.1 g/L，硫酸铵2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，磷酸氢二钠1 g/L。采用Plackett-Burman试验设计从影响抗菌脂肽产生的9个培养基组份中筛选显著组份。选择实验次数N=12的试验设计，考察9个因素，每个因素取2水平，高水平因子是低水平因子的1.5倍，增加2个空项用以估计误差(表1)。

1.2.6 爬坡试验设计 依据Plackett-Burman试验结果设计爬坡试验，以显著因素的效应值确定爬坡路径和步长，正效应因素取高值，负效应因素取低值，改变显著因素在培养基中的质量浓度使其成适当的梯度，确定抗菌脂肽产量的变化趋势，从而快速逼近最佳响应值区域。

表1 Plackett-Burman设计因子与水平

1.2.7 响应面分析 利用Box-Behnken 的中心组合设计原理，根据爬坡试验得到的显著因素响应区域中心点，设计3因子3水平共17个实验点的响应面分析试验。

1.2.8 数据分析 每个处理3次重复，取平均值。利用 Minitab16 软件进行Plackett-Burman 试验分析，利用Design-Expert 8.0完成Box-Behnken响应面分析。

2 结果与分析

2.1 基础发酵培养基筛选

3种培养基中抗菌脂肽的产量和抑菌活性见表2。抑菌活性与抗菌脂肽干重成正相关，LB培养基中抗菌脂肽产量最少，NYD次之，A最高。结果表明，培养基中添加葡萄糖和无机盐能够提高抗菌脂肽产量，因此选A培养基作为基础发酵培养基进行后续响应面优化研究。

表2 不同培养基对菌株TF28分泌抗菌脂肽的影响

2.2 Plackett-Burman 试验设计与结果

对每个处理得到的抗菌脂肽称重后进行抑菌活性测定，结果表明抑菌活性与抗菌脂肽干重成正相关，因此，以抗菌脂肽干重为响应值。

Plackett-Burman试验结果表明6号实验抗菌脂肽产量最高为1.09 g/L(表3)。各因素水平与效应分析结果表明，葡萄糖、酵母膏、硫酸锰和磷酸氢二钠4个组份对抗菌脂肽产量呈正效应，硫酸铵、牛肉膏、氯化钙、硫酸镁和磷酸二氢钾5个组份呈负效应(表4)。培养基组份对抗菌脂肽产量的影响显著性为：葡萄糖>磷酸氢二钠>硫酸镁>酵母膏>磷酸二氢钾>硫酸铵>硫酸锰>氯化钙>牛肉膏，葡萄糖、磷酸氢二钠和硫酸镁的影响较为显著，葡萄糖和磷酸氢二钠有显著正效应，硫酸镁有显著负效应，提高葡萄糖和磷酸氢二钠含量，降低硫酸镁含量有助于提高抗菌脂肽产量。效应关系回归模拟方程：Y=0.344+0.176 6A-0.026 6B+0.073 4C-0.006 6E-0.023 4F+0.026 8G-0.156 6J-0.056 6K+0.173 4L，R2=0.910 8，表明回归有效。

表3 Plackett-Burman 试验设计与结果

表4 Plackett-Burman 设计因素水平及效应评价

2.3 爬坡试验

以Plackett-Burman试验结果中抗菌脂肽产量最大的试验组为基础，固定6个非显著组份浓度，正效应取高值，负效应取低值，3个显著组份设5个浓度进行爬坡试验，葡萄糖和磷酸氢二钠向高浓度爬，硫酸镁向低浓度爬。结果表明第2组试验抗菌脂肽产量最大，为1.79 g/L(表5)。因此选择葡萄糖、硫酸镁和磷酸氢二钠的浓度分别为40、 0.2和3 g/L为中心点进行Box-Behnken 设计。

表5 爬坡试验设计及结果

2.4 响应面分析

3个显著组份自变量水平见表6，Box-Behnken设计与结果及方差分析见表7和表8。该模型的线性和平方对抗菌脂肽的影响显著，而交互作用不显著，显著因素影响程度：葡萄糖>硫酸镁>磷酸氢二钠。拟合回归方程: Y=1.712+0.133 75A-0.057 5B-0.003 75C+0.122 5AB-0.065AC-0.037 5BC-0.311A2-0.378 5B2-0.411C2。模型回归p值为0.000 3，失拟项P值0.160 4，R2=0.964 7, 说明模型具有很好的显著性。从方程推断出模型的最佳值为葡萄糖42.37 g/L，硫酸镁2.11 g/L,磷酸氢二钠3 g/L,理论上抗菌脂肽的产量达1.73 g/L。

依据拟合回归方程，通过Design-Expert 8.0 软件分析获得相应的响应面分析图和等高线图(图1)，其中一个因素固定在最优值，抗菌脂肽产量随着其他2个因素水平的增加呈现先增加后降低趋势，曲面定点即为抗菌脂肽最大值点。

表6 Box-Behnken 设计因素与水平

表7 Box-Behnken 设计与结果

续表7

表8 回归模型方差分析

注：A：葡萄糖；B：硫酸镁；C：磷酸氢二钠

图1 显著组份交互作用的响应面和等高线图Fig.1 Response surface plot and contour plot of three main components interactionA: 响应面；B：等高线图A: Response surface plot; B: Contour plot

2.5 验证试验

根据响应面分析结果，3个显著组分取最优值，其他组分依据PB试验结果正效应组分取高值，负效应组分取低值，进行摇瓶培养，3个重复，抗菌脂肽产量分别为1.68、1.76和1.83 g/L，平均值为(1.75±0.05) g/L，比基础发酵培养基抗菌脂肽产量提高6.25倍，实际值接近预测值1.73 g/L，说明模型有效。优化后解淀粉芽胞杆菌TF28产抗菌脂肽培养基配方为葡萄糖42.37 g/L，硫酸镁2.11 g/L,磷酸氢二钠3 g/L, 牛肉膏2 g/L，酵母膏2 g/L，硫酸锰0.1 g/L，氯化钙0.1 g/L，硫酸铵2 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L。

3 讨 论

抗菌脂肽由非核糖体途径合成，受较大基因簇和多酶复合体调控[16]。同一菌株产生的抗菌脂肽的种类是一定的，但在不同培养条件下其种类和产量是不同的。培养基组份与抗菌脂肽的合成密切相关，对抗菌脂肽的产量有较大影响，但是否对种类有影响因菌株而异。李兴玉等[8]报道培养基组分对BacillussubtilisXF-1菌株的抗菌脂肽的产量有影响，对种类没有影响；孙力军等[9]和赵朋超等[7]报道培养基组份对解淀粉芽胞杆菌ES-2和 Q-426的抗菌脂肽种类和产量均有影响，这可能是由于有些菌株的某种抗菌脂肽合成基因处于沉默状态，需要特定培养基组份诱导才能表达。

碳氮源和无机盐是微生物生长所必备的营养因子，也是培养基优化的主要考察因素。碳氮源是合成抗菌脂肽必须营养成分，对抗菌脂肽产量影响较大。有研究表明糖类物质利于抗菌脂肽的积累[17]，葡萄糖、蔗糖和淀粉是芽胞杆菌产抗菌脂肽的常用碳源，葡萄糖是多数菌株的优选碳源。氮源对抗菌脂肽产量的影响因菌株而异，赵朋超等[7]在优化解淀粉芽胞杆菌Q-426培养基研究中发现应用无机氮尿素不能产生抗菌脂肽，应用有机氮蛋白胨和L-氨基酸能够产生抗菌脂肽；卢彩鸽等[18]对解淀粉芽胞杆菌MH71培养基优化研究中发现应用复合有机氮牛肉膏和蛋白胨促进抗菌物质的产生；杨代凯等[19]发现解淀粉芽胞杆菌ZM9利用豆粕作氮源，抗菌脂肽iturinA的产量最高，利用铵态无机氮作氮源不产生抗菌脂肽iturinA；孙力军等[9]发现单独用有机氮、无机氮和氨基酸或有机和无机复合氮源对解淀粉芽胞杆菌 ES-2来说都能产生抗菌脂肽，单独用L-谷氨酸时抗菌脂肽产量最高；朱玲燕等[20]发现枯草芽胞杆菌BS-37利用硝酸铵做氮源，surfactin产量最高；叶云峰等[21]、孙亮等[22]发现枯草芽胞杆菌B47和HAB-1利用酵母粉和酵母膏作氮源，抗菌物质产量最高。金属离子和无机盐对抗菌脂肽的产生也有一定影响，铁、镁、锰离子能促进抗菌脂肽的产生[23-25]。

本研究综合考虑碳氮源和无机盐对菌株TF28产抗菌脂肽的影响，设计了没有糖类物质的LB、有糖类和有机氮的NYD及营养全面的A培养基(含糖类、有机无机氮源和无机盐)可以快速筛选出基础发酵培养基，结果表明葡萄糖能够促进菌株TF28抗菌脂肽的产生，营养全面的A培养基抗菌脂肽产量最高，说明碳氮源和无机盐协同作用能够显著提高菌株TF28抗菌脂肽的产量。以A培养基为基础发酵培养基进行响应面分析，结果表明葡萄糖、金属镁离子和无机盐磷酸氢二钠是影响菌株TF28抗菌脂肽产量的3个显著因素，较高浓度的葡萄糖和无机盐及较低浓度的镁离子能够显著提高抗菌脂肽产量。优化后的最适葡萄糖用量为42.37 g/L，高于文献报道的其他芽胞杆菌(菌株MH71的葡萄糖用量为14 g/L，菌株XF-1的葡萄糖用量为20 g/L，HF-01的葡萄糖用量为30 g/L)。优化后的最适硫酸镁用量2.11 g/L，与文献报道一致。磷酸氢二钠影响抗菌脂肽产量为本菌株特有。

抗菌脂肽是菌株的次级代谢产物，通常情况下产量较低，经过培养基优化后能够提高其产量，产量提高幅度存在菌株差异性。本研究应用响应面方法确定了菌株TF28产抗菌脂肽最佳发酵培养基组份为葡萄糖42.37 g/L，酵母膏2 g/L，牛肉膏2 g/L，硫酸铵2 g/L，硫酸镁2.11 g/L，氯化钙0.1 g/L，硫酸锰0.1 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，磷酸氢二钠 3 g/L，抗菌脂肽产量为1.75 g/L，比优化前提高了5.25倍，但与文献报道的其他菌株相比产量偏低。方传记等[26]报道解淀粉芽胞杆菌ES-2-4经过培养基优化后抗菌脂肽产量达6.76 g/L。杨代凯等[19]报道解淀粉芽胞杆菌ZM9培养基优化后iturinA产量达3.37 g/L。因此后续研究拟从培养条件及基因改造方面进一步优化菌株TF28以提高抗菌脂肽产量，为抗菌脂肽的商品化提供菌株资源。

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Optimization of Medium for the Production of Antifungal Lipopeptides byBacillusamyloliquefaciensTF28

LIU Yu-shuai1, 2, MENG Li-qiang1,2, CHEN Jing-yu1, JIANG Wei1, 2, CAO Xu1, 2,HU Ji-hua1, LI Jing1, 2, ZHANG Shu-mei1,2

(1.Inst.ofMicrobiol.,HeilongjiangAcad.ofSci.,Harbin150010; 2.Inst.ofAdvancedTech.,HeilongjiangAcad.ofSci.,Harbin150020)

In order to improve the production of antifungal lipopeptides (AL) byBacillusamyloliquefaciensTF28, the response surface method was adopted. Three major factors influencing the production of AL, glucose, MgSO4, and Na2HPO4were screened adopting Plackett-Burman experiment design. The optimal level of the significant components were confirmed through steepest ascent experiment to approach the most responsing value area, and the response surface analysis method. The results showed that the medium components of the optimized medium were glucose 42.37 g/L, yeast extract 2 g/L, beef extract 2 g/L, (NH4)2SO42 g/L, MgSO42.11 g/L, CaCl20.1 g/L, MnSO40.1 g/L, KH2PO41.5 g/L，Na2HPO43 g/L. It was proved by three parallel experiments that the yield of AL was 1.75 g/L under optimal condition, increased by 5.25 times higher than that of medium before optimized. This study had optimized the medium for the increment of the production of AL byB.amyloliquefaciens, and laid the foundation for the AL production.

Bacillusamyloliquefaciens; antifungal lipopeptides (AL); medium optimization

中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室开放课题(SKLMR-20150604)；黑龙江省省院科技合作

刘宇帅 女，助理研究员，硕士。研究方向为植物病害生物防治。E-mail:ttkqbzj@163.com

* 通讯作者。女，研究员，博士。研究方向为植物病害生物防治。E-mail:1401135157@qq.com

2016-08-23；

2016-09-13

Q939.9

A

1005-7021(2017)03-0052-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.010

项目(YS16C15)