不同处理方法对肺炎链球菌基因组提取的影响

黄 洋， 李 康， 杨 越， 陈 驰， 梁 丽， 叶 强， 陈翠萍

(中国食品药品检定研究院 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050)

不同处理方法对肺炎链球菌基因组提取的影响

黄 洋， 李 康， 杨 越， 陈 驰， 梁 丽， 叶 强*， 陈翠萍

(中国食品药品检定研究院 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050)

为了获得简便、高效的提取肺炎链球菌基因组DNA方法，分别采用不同处理方法(溶菌酶法和脱氧胆酸钠(DOC)法)、不同处理时间对8株不同血清型的肺炎链球菌进行破壁，同时菌株采用不同培养时间进行基因组的提取，提取基因组后利用紫外分光光度计测定样品中DNA 的浓度和纯度以及琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 的质量。结果表明，菌株培养12～16 h、质量分数1%DOC处理2 h能提取出高质量的肺炎链球菌基因组DNA。该方法提取的肺炎链球菌基因组DNA具有质量高、完整性好的优点，为肺炎链球菌全基因组序列的测定提供了前提条件。

肺炎链球菌；基因组提取；不同破壁方法；不同培养时间

肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)又称肺炎双球菌或肺炎球菌，是一种革兰阳性双球菌，有荚膜结构，荚膜是肺炎链球菌的主要毒力因子[1-2]。根据荚膜多糖结构和成分的不同，肺炎链球菌目前可分成46个血清群和93个不同的血清型[2-3]。多数微生物物种的基因是一个动态实体，基因的水平转移会导致基因的变化，从而影响细菌的毒力和细菌相关疾病的病原学行为[4]。在以高通量测序为研究手段研究肺炎链球菌全基因组序列和比较基因组学分析时，提取高质量的基因组DNA 成为最基础的工作。基因组的提取主要包括破壁和核酸抽提，由于肺炎链球菌细胞壁比较坚韧，因此提取基因组DNA 的关键在于选择一种合适的方法，使菌体内核酸释放出来。本研究分别比较不同处理方法(溶菌酶法和脱氧胆酸钠(DOC)法)、不同处理时间进行破壁、菌株培养不同时间对提取的全基因组质量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 肺炎链球菌CMCC(B)31213、31214、31226、31540、31541、31546、31547、31601来自中国医学细菌保藏管理中心，其中31213为9群9A型，31214为9群9L型，31540、31541为9群9N型，31546、31547为9群9V型，31601为14群。

1.1.2 试剂及仪器 THB培养基、酵母提取物购自美国BD公司，脱纤维羊血购自北京陆桥技术股份有限公司，脱氧胆酸钠(DOC)购自美国Sigma公司，DNA提取试剂盒购自美国Qiagen公司(货号69506)，NanoDrop2000超微量分光光度计购自美国Thermo公司。

1.1.3 培养基 THBY培养基(即质量分数为0.25% Yeast的THB)由中国食品药品检定研究院培养基室配制。

1.2 方法

1.2.1 不同破壁方法对肺炎链球菌全基因组的影响 取10 mL THBY培养基中的菌液于3500 r/min离心15 min，弃去上清，菌体用1mL TE buffer重悬，制备成菌悬液。用5 mg/mL溶菌酶、质量分数分别为0.25%、0.5%、1%、2%、4% DOC处理菌悬液相同的时间后，按照DNA提取试剂盒说明书进行全基因组DNA的提取。

1.2.2 DOC处理不同时间对肺炎链球菌全基因组的影响 在菌悬液中加入DOC，使DOC最终的质量分数为1%，将菌液置于37 ℃处理1、2、3、4、5、24 h，然后按照DNA提取试剂盒说明书进行全基因DNA的提取。

1.2.3 不同培养时间对肺炎链球菌全基因组完整性的影响 肺炎链球菌于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，分别培养6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h后取出2 mL菌液，然后按照DNA提取试剂盒说明书进行提取。

1.2.4 基因组DNA质量的检测 提取基因组后采用NanoDrop2000超微量分光光度计测定样品中DNA的浓度和纯度，同时取5 μL基因组在1.0%的琼脂糖凝胶电泳下检测，GelRed染色，凝胶成像仪下观察其条带直观检测其DNA 质量。

2 结果与分析

2.1 不同破壁方法对肺炎链球菌全基因组的影响

利用琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA 样品，结果如图1所示。溶菌酶破壁法提取的基因组条带模糊，拖尾明显，说明样品中基因组可能出现降解现象，且有较多的RNA残留；而DOC提取的肺炎链球菌基因组条带清晰，降解较少。

图1 不同处理方法对肺炎链球菌全基因组的影响Fig.1 The effects of different treatments on Streptococcus pneumoniae genome* “%”为质量分数;Marker:λ-Hind Ⅲ digest* “%” means mass fraction;Marker:λ-Hind Ⅲ digest

对不同浓度DOC破壁提取的基因组DNA采用NanoDrop2000进行定量比较，结果见图2，有7株菌株(CMCC(B)31213、CMCC(B)31226、CMCC(B)31540、CMCC(B)31541、CMCC(B)31546、CMCC(B)31547、CMCC(B)31601)在质量分数1%DOC破壁后提取的基因组DNA的量最大，1株菌株(CMCC(B)31214)在质量分数0.5%DOC破壁后提取的基因组DNA量最大(114 ng/μL)，但与1%DOC破壁后提取的基因组DNA的量(103 ng/μL)相差不大。因此后续实验采用质量分数为1%DOC破壁来比较DOC处理不同时间和菌株不同培养时间对肺炎链球菌全基因组DNA的影响。

图2 不同质量分数DOC对肺炎链球菌基因组浓度的影响Fig.2 The effects of different mass fractions of DOC on Streptococcus pneumoniae genome

2.2 DOC处理不同时间对肺炎链球菌全基因组的影响

DOC处理不同时间提取的基因组结果见图3。2株菌株(CMCC(B)31547、31601)在质量分数1%DOC处理2 h后提取的基因组浓度到达峰值，6株菌株(CMCC(B)31213、CMCC(B)31214、CMCC(B)31226、CMCC(B)31540、CMCC(B)31541、CMCC(B)31546)在质量分数1%DOC处理3 h后提取的基因组浓度到达峰值，但与2 h后提取的基因组浓度相差不大。而后提取基因组的浓度随着时间的延长而逐渐降低。因此后续实验采用质量分数为1%DOC处理2 h来比较菌株不同培养时间对肺炎链球菌全基因组DNA的影响。

图3 DOC处理不同时间对肺炎链球菌全基因组浓度的影响Fig.3 The effects of different treatment time of DOC on Streptococcus pneumoniae genome

2.3 不同培养时间对肺炎链球菌全基因组的影响

不同培养时间肺炎链球菌提取的基因组DNA结果见图4。在菌株培养18 h前，随着培养时间的延长，基因组的浓度逐渐增加，在12～16 h提取的基因组DNA条带清晰，且浓度较好，在18 h时提取的基因组DNA发生了严重的降解；而后提取的基因组浓度降低，且存在明显的降解。说明肺炎链球菌在培养12～16 h可以得到浓度高、质量好的基因组DNA。

图4 不同培养时间对肺炎链球菌全基因组完整性的影响Fig.4 The effects of different cultural time on Streptococcus pneumoniae genome

3 讨 论

随着高通量测序技术和生物信息学等的发展，国内外已完成了多种微生物的全基因组测序，人们从基因水平上对这些微生物有了更深的认识。肺炎链球菌是一种能够引起所有年龄组高发病率和病死率的致病菌，尤其是儿童和老年人[5]；在发达国家仍然是能够引起高病死率传染性疾病的少数几种细菌性病原之一[6-7]。深入研究肺炎链球菌全基因组序列，将有助于相关疾病的防治以及疫苗的研发与质量控制。提取高质量的基因组DNA已成为获得准确全基因组序列的关键环节和首要条件。

革兰阳性菌提取过程关键环节在于破壁，微生物细胞壁的结构和强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互交连的程度，破碎细胞的阻力来自于连接细胞壁网状结构的共价键[8-9]。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4 糖苷键[10-11]。DOC可使自溶素LytA被激活，水解N-乙酰胞壁酸与丙氨酸之间的连接键，从而破坏细菌细胞壁，引起细菌自溶；而0.1%或更高浓度的胆碱不会介导LytA活性形式的转换，反而会以非竞争抑制形式抑制其活性[12]。通过不同处理方法对肺炎链球菌基因组DNA的研究表明，溶菌酶破壁法提取的基因组条带模糊，拖尾明显，样品中基因组可能出现降解现象或者是有较多的RNA残留；而DOC提取的肺炎链球菌基因组条带清晰，降解较少，尤以DOC的终浓度为1%时，提取的基因组DNA浓度最高。通过DOC处理不同时间提取的基因组结果表明，在质量分数1%DOC处理2～3 h后提取的基因组浓度到达峰值，而后提取基因组的浓度随着时间的延长而逐渐降低；由于质量分数为1%DOC处理3 h后提取的基因组浓度到达峰值的菌株与2 h后提取的基因组浓度相差不大，为了节省实验时间，采用质量分数为1%DOC处理2 h进行基因组DNA的提取。肺炎链球菌的培养时间与基因组的数量和质量也存在密切关系。在菌株培养12～16 h提取的基因组DNA条带清晰，且浓度较好，在18 h时提取的基因组DNA发生了严重的降解；说明肺炎链球菌在培养12～16 h可以得到浓度高、质量好的基因组DNA。

综上所述，菌株培养12～16 h、质量分数为1%DOC处理2 h能提取出高质量的肺炎链球菌基因组DNA。该方法是一种较为实用、经济、高效的提取肺炎链球菌基因组的方法，提取的基因组DNA含量高、纯度大，获得的基因组完整，非常适用于对基因组完整性要求较高的菌株全基因组序列的测定。

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The Effects of Different Treatments on ExtractingStreptococcuspneumoniaeGenome

HUANG Yang, LI Kang, YANG Yue, CHEN Chi, LIANG Li, YE Qiang, CHEN Cui-ping

(ChinaInst.forFood&DrugCtrl.,KeyLab.ofMethod&Standardiz’nforQual.Ctrl.ofBiothech.Products,Minist.ofPublicHealth,Beijing100050)

In order to acquire a convenient and efficient method to extract genome DNA fromStreptococcuspneumoniae, different treatments (lysozyme and sodium deoxycholate, DOC for short) and different treatment time to break cell walls of eight strains of different serotypes, separately. Meanwhile, the effects of different culture time of these strains on extracted genome were investigated. After extracting genome, ultraviolet spectrophotometer was used to test the concentration and purity of genome DNA, and test the quality of genome DNA with agarose gel electrophoresis. The results showed that high-quality genomes ofS.pneumoniaeare extracted when the strains are cultured for 12-16 h and treated with 1% DOC for 2 h. The method is proven to be a practical, economic, efficient method to extractS.pneumoniaegenome. The extracted genome was high content, purity and intact and very suitable for complete genome sequencing.

Streptococcuspneumoniae; genome extraction; different cell wall-breaking methods; different culture time

国家重大新药创制项目(2013ZX09304101)

黄洋 女，博士研究生。主要从事菌种鉴定研究。E-mail：huangyang@nifdc.org.cn

* 通讯作者。男，硕士，主任技师。主要从事疫苗质量控制和菌毒种鉴定研究。E-mail:qiangyee@nifdc.org.cn

2016-06-22；

2016-07-11

Q939.93

A

1005-7021(2017)03-0039-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.007