液相色谱-串联质谱法测定饲料中3种异噻唑啉酮

张 丽，董丽君，刘 琳，许美玲，杨 娟，杜 震

(1.山东临沂出入境检验检疫局，山东 临沂 276034； 2.山东出入境检验检疫局，山东 青岛 266001)

液相色谱-串联质谱法测定饲料中3种异噻唑啉酮

张 丽1，董丽君1，刘 琳2，许美玲1，杨 娟1，杜 震1

(1.山东临沂出入境检验检疫局，山东 临沂 276034； 2.山东出入境检验检疫局，山东 青岛 266001)

建立了测定饲料中3种异噻唑啉酮的液相色谱-串联质谱检测方法。以甲醇为提取剂，超声法提取30 min，离心后浓缩定容，上机检测。用Eclipse Plus C18色谱柱进行分离，以30%甲醇和70%的去离子水为流动相，等梯度洗脱，采用多反应监测离子模式进行定性分析。方法回收率在75.8～102%，相对标准偏差为1.63%～5.75%。操作简单，测定结果准确，可用于饲料中异噻唑啉酮的检测。

饲料；异噻唑啉酮；超声提取；液相色谱-串联质谱

饲料安全是动物性食品安全的基础,是关乎食品安全的大事，是全社会关注的热点。我国现阶段饲料安全工作仍存在以下问题：一是饲料标准体系建设滞后。相对于发达国家的饲料卫生标准，我国的饲料卫生标准中监管项目偏少。新的农药、兽药、添加剂以及防腐剂等的不断出现，测定方法及测定仪器灵敏度的不断提高，也使得对现行饲料卫生标准的覆盖面及有毒有害物质限量的规定提出了新的要求。二是缺少通用性强、权威性高的饲料中违禁药物和添加剂的检测方法。目前，各地违禁药品检测大多使用国外或国际标准，方法不一致，对比性差，有些违禁药物甚至没有针对性的检测方法，因此，亟需制定国家或行业标准。异噻唑啉酮类化合物具有抗菌能力强、应用剂量小、相容性好、药效持续时间长等性能，在工业、农业、医药等行业得到了广泛应用[1-2]。根据中华人民共和国农业部公告第2045号公告，异噻唑啉酮类药物不在饲料添加剂品种目录中，属于违禁药物。通过查阅文献，饲料中异噻唑啉酮检测的研究尚属空白，因此，有必要建立相应的分析方法，为饲料卫生标准的制定和修改以及饲料中违禁药品和添加剂的检测提供技术支持。

目前涉及异噻唑啉酮的测定的产品很多，主要有食品接触材料、水、纺织品、皮革、化妆品、环境样品、玩具等方面[3]。检测的方法主要有碘量法[4]、气相色谱法[5]、液相色谱法等[6]。近年来，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术[7]快速发展，已经越来越多地被应用于化妆品、环境等领域水相样本中异噻唑啉酮类化合物含量的检测。与气相色谱-质谱和液相色谱-紫外检测相比，LC-MS/MS更加适合于复杂体系中异噻唑啉酮的测定，而且分析时间短，灵敏度高，因此受到了广泛的关注。

本文采用超声萃取，样品前处理方法简单，方法快捷，回收率高，检出限低，填补了饲料中异噻唑啉酮检测的空白。

1 材料与方法

1.1试验材料

甲醇：色谱纯；丙酮：色谱纯；乙酸乙酯：分析纯；乙醇：分析纯；3种异噻唑啉酮均购于德国Dr．Ehrenstorfer公司，2-甲基-4异噻唑啉-3酮MI：纯度≥98.0%；5-氯-2甲基-4异噻唑啉-3酮CMI：纯度≥99.0%；1,2苯并异噻唑啉-3酮BIT：纯度≥99.5%；地瓜干颗粒饲料等。

表1 异噻唑啉酮种类表

1.2试验设备

液相色谱串联质谱仪：Agilent 1200快速液相色谱仪，6410 Triple Quad 质谱仪；超声波提取器：SK8200H；均质器：ULTRA-TURRAX T25；离心机：Eppendorf CR22GⅢ；旋转蒸发仪：chiller F100；乙二胺-N-丙基硅烷吸附柱：SAX PSA；涡流混匀器：IKA MS3基本型；超纯水器：Milli-Q；电子天平：感量0.001；塑料离心管：50 ml；圆底烧瓶：100 ml；烧杯：1 000 ml；锥形瓶：具磨口塞100 ml；0.22 μm有机滤膜；移液枪：Eppendorf 1 000 μl、5 ml、10 ml。

2 试验方法

2.1样品前处理

准确称取粉碎后检测用样品1.00 g(精确至0.01 g)置于100 ml磨口烧瓶中，加入20 ml甲醇，超声提取30 min，收集上清液至离心管中，加入10 ml甲醇二次超声提取10 min，合并上清液。以5 000 r/min离心5 min，(必要时过PSA小柱)转移至鸡心瓶中旋转蒸干，用甲醇定容至5 ml，过0.22 μm滤膜，进行LC-MS/MS测定。

2.2色谱质谱条件

通过查阅文献和对不同碰撞能和出口电压下检测结果的比较，得出能保证色谱测定时被测组分能够得到有效的分离的参数。液相色谱条件：

(1)色谱柱： Eclipse Plus C18(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)。

(2)流动相：A为甲醇溶液30%，B为去离子水70%，等梯度洗脱。

(3)色谱柱温：35℃。

(4)进样体积：5 μl。

(5)离子源：ESI，正离子扫描。

(6)雾化器压力：310 kPa。

(7)毛细管电压：4 000 V。

(8)扫描方式：MRM。

(9)检测离子对、毛细管出口电压/碎裂电压、碰撞能等质谱采集参数见表2。

表2 质谱采集参数

3 结果与讨论

3.1色谱条件的选择

由于三种异噻唑啉酮均具有一定的极性，选择对极性样品具有较好保留值和分离度的Eclipse Plus C18(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)色谱柱，通过查阅文献[7]用甲醇/去离子水作为流动相洗脱，分离效果较好。考察了甲醇∶水比例为15%∶85%、20%∶80%、30%∶70%、50%∶50%等梯度洗脱时出峰情况，发现甲醇∶水比例为30%∶70%时峰形尖锐、出峰时间和出峰效果最好，见图1。

1.2甲基-4异噻唑啉-3酮;2.5-氯-2甲基-4异噻唑啉-3酮; 3.1,2苯并异噻唑啉-3酮

3.2样品前处理条件的优化

准确称取粉碎后检测用样品1.00 g(精确至0.01 g)，考察了甲醇、丙酮、乙酸乙酯、去离子水4种不同极性的溶剂，振荡萃取3～4 h，收集上清液至离心管中，离心、过PSA净化小柱、旋蒸后定容至5 ml，在上述色谱质谱条件下测定，结果见表3。

表3 不同极性溶剂萃取结果

由表3可知。，甲醇萃取效果最好，丙酮和乙酸乙酯次之，综合考虑萃取效果、试剂价格和毒性，研究采用甲醇作为萃取溶剂。

3.3标准曲线与检出限

用甲醇配制浓度均为100 mg/L的MI，CMI，BIT混合标准溶液，做为标准储备液，用甲醇配制成10 mg/L标准中间储备液，用样品空白处理液逐级稀释浓度为0.05、0.1、0.5、1、2 mg/L的混合标准溶液，在上述色谱质谱条件下测定，结果表明MI，CMI，BIT在0～2.0 mg/L线性范围内三种异噻唑啉酮的质量浓度与响应值呈现良好的线性关系，如表4所示。

以空白样品基质稀释标准曲线上最低浓度出峰时，取信噪比S/N=3和样品处理过程的稀释倍数计算得出检出限(LOD),信噪比S/N=10和样品处理过程的稀释倍数计算得出定量限(LOQ)。

表4 三种异噻唑啉酮的线性关系与检出限

3.4回收率和精密度

对方法做3水平6平行的添加回收试验，结果见表5。

由表5可知：平均回收率75.8%～102%，相对标准偏差1.63%～5.75%，所建方法重复性较好，回收率满意。

表5 回收率和精密度

3.5实际样品检测

为了将此方法应用于饲料的检测，进一步测试此方法的适用性，我们随机对几个饲料样品进行了检测。检测情况见表6。

表6 实际样品检测结果

检测发现：个别饲料中MI和BIT有少量检出，CMI均为未检出。

4 结论

综上所述，我们建立了一种同时测定饲料中三种异噻唑啉酮的液相色谱串联质谱分析方法，以甲醇为萃取溶剂，采用超声萃取对饲料中的异噻唑啉酮进行萃取，萃取液经处理后进行液相色谱串联质谱分析。该方法较简便快速、定性准确、灵敏度高，填补了饲料中异噻唑啉酮检测的空白。

[1] 马宣宣，张洪涛，赵 君，等．异噻唑啉酮类衍生物的合成及其抗菌效应[J]．中国涂料，2012，27(5)：47-50．

[2] 刘铁岩，张聪敏，王兴民，等．异噻唑啉酮衍生物的应用：中国，1236542[P]．1999-12-01.

[3] 周 晓,李小兰,陈志燕,等.高效液相色谱法测定水基胶黏剂中3 种异噻唑啉酮类杀菌剂[J].色谱，2015，33:75-79.

[4] European standard prEN 71-11：2005.safety of Toys-Part 11：Organic Chamical Compounds-Methods of Analysis[S].

[5] 陈安东,吴兆伟,余 倩,等.GC/MS法同时分析液体制剂及口服液型保健品中31种防腐剂和抗氧化剂[J].质谱学报,2014,35:438-446.

[6] 赵美丽.HPLC法测定化妆品中的甲基异噻唑啉酮及其氯代物[J].江西化工,2013(4):188-195.

[7] 杨荣静,卫碧文,于文佳,等.液相色谱-串联质谱法检测玩具中的3种异噻唑啉酮类防腐剂[J].色谱，2011,29:513-516.

(责任编辑：梅竹)

Determinationof3isothiazolinonesinfeedstuffusingliquidchromatography-tandemmassspectrometry

Zhang Li ，Dong Li-jun，Liu Lin ，Xu Mei-ling，Yang Juan，Du Zhen

(1.Shangdong Linyi Entry Inspection and Quarantine Breau,Linyi 276034,China;2. Shangdong Entry Inspection and Quarantine Breau,Qindao 266001,China)

A method for determination of 3 isothiazolinones in feedstuff was developed by LC-MS/MS.The samples was extracted by ultrasonic for 30 min,the extract was centrifuged and the concentrate was diluted,and then determined by LC-MS/MS. The HPLC was carried out on Eclipse Plus C18column,the mobile phase was 30% methanol and 70% deionized water with gradient elution. The mass spectrometer was operated in a multiple reaction monitoring (MRM) mode. The recovery rate was distributed in the range of 75.8%-102% and the RSD was distributed in the range of 1.63%-5.75%.The method was simple and accurate,which could be used in the determination of the residues of isothiazolinones in feedstuff.

feedstuff;isothiazolinone;ultrasonic extraction;LC-MS/MS

2017-05-23；

2017-07-18

山东出入境检验检疫局科技项目“液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测饲料中异噻唑啉酮类防腐剂方法研究”(SK201460)。

张 丽(1981-)，女，高级工程师。主要从事实验室检测工作。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.08.013

S816.17

：A

：1003-6202(2017)08-0055-04