维药神香草对治疗哮喘大鼠的免疫机制研究

徐 茜，马雪萍，贺家勇

·基础研究·

维药神香草对治疗哮喘大鼠的免疫机制研究

徐 茜，马雪萍，贺家勇

目的观察维药神香草对哮喘大鼠白介素(interleukin，IL)-6、嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)的影响，探讨其治疗哮喘的部分免疫机制。方法将健康Wistar大鼠50只随机分为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松组、神香草多糖低剂量组、神香草多糖高剂量组5组，每组10只。正常对照组腹腔注射1 mL无菌生理盐水；其余4组激发致敏引喘，每天灌胃给药1mL(地塞米松组给药为0.5 mg/kg，神香草多糖低、高剂量组灌胃分别为0.65、2.60 g/kg)。药物干预1周后，末次激发结束后24 h内，每组随机取8只大鼠，支气管肺泡灌洗，收取支气管肺泡灌洗液，测量EOS。采用免疫组织化学法检测肺组织中IL-6的表达水平。用图像Pro-Plus分析软件进行灰度分析。结果5组间支气管肺泡灌洗液中EOS差异有统计学意义(P＜0.001)。哮喘模型组EOS高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.001)。神香草多糖低、高剂量组EOS明显低于哮喘模型组，差异均有统计学意义(P＜0.001)；神香草多糖低剂量组EOS高于地塞米松组，差异有统计学意义(P＜0.01)；神香草多糖高剂量组EOS与地塞米松组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。IL-6在胞浆表达，支气管纤毛柱状上皮细胞和浸润的炎细胞出现阳性表达，肺泡间质也出现少量的表达。哮喘模型组IL-6的表达高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.001)；神香草多糖低、高剂量组IL-6的表达低于哮喘模型组，差异均有统计学意义(P＜0.001)；神香草多糖低、高剂量组IL-6与地塞米松组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论神香草多糖可抑制哮喘大鼠IL-6的分泌，降低肺泡灌洗液中EOS，减轻哮喘大鼠的炎症反应，提示神香草多糖具有较好的抗炎作用。

维药；神香草；哮喘；免疫机制；白介素-6；大鼠

支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)、肥大细胞、T细胞、中性粒细胞等多种细胞参与的慢性气道炎性疾病[1-2]。哮喘的发病机制较为复杂，目前研究哮喘发病的关键在于气道变应性炎症。变应性哮喘发生过程中重要的免疫学改变是辅助性T细胞(helper T cell，Th)1/Th2失衡，主要表现为Th2细胞因子白介素(interleukin，IL)-4、IL-6等产生增多，而Th1数量减少，功能减弱，细胞因子IL-12、γ-干扰素等减少[3-4]。目前治疗哮喘的药物主要分为缓解哮喘发作和控制哮喘发作2类药物，由于这些药物治疗时间较长，尤其是糖皮质激素具有一定的副作用[5]，有必要寻找新的药物治疗哮喘。维药神香草为唇形科多年生草本植物，维吾尔名为祖帕奇尼(祖帕)，维吾尔医学常用其治疗气管炎咳嗽、气喘、感冒发热和风湿等病症[6-7]。本研究通过制备哮喘动物模型，分析维药神香草对相关细胞因子的影响，旨在探讨维药神香草对哮喘大鼠的免疫机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 6周龄健康Wistar大鼠50只，体重170～200 g，购自新疆医科大学实验动物中心[SCXK-(新)2003-2001]，将50只大鼠随机分为5组(n＝10)，即正常对照组、哮喘模型组、地塞米松组、神香草多糖低剂量组、神香草多糖高剂量组。

1.1.2 试药与主要仪器 神香草购于新疆维吾尔医院，由李永和主任药师鉴定为唇形科神香草属神香草。按参考文献[8]制备神香草多糖提取液，根据人的推荐剂量3～6 g，设定神香草多糖低剂量组和高剂量组灌胃剂量分别为0.65 g/kg和2.60 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备与药物干预 大鼠适应性饲养2周，实验第1天和第8天，正常对照组腹腔注射无菌生理盐水1 mL，其余4组腹腔注射由10 mg卵清蛋白(ovalbumin，OVA)+100 mg氢氧化铝+0.2 mL百白破混合疫苗组成的混悬液1mL以致敏。从第15天开始，除正常对照组外，其余4组以10% OVA生理盐水雾化吸入20 min以激发引喘，观察大鼠出现烦躁不安、呼吸急促、有明显的腹式呼吸、皮肤瘙痒、呛咳等症状时，提示引喘成功。各用药组于每天激发前30 min灌胃给药1 mL(地塞米松组给药为0.5 mg/kg，神香草多糖低、高剂量组灌胃分别为0.65、2.60 g/kg)。实验第21天(药物干预1周后)，末次激发结束后24 h内，每组随机取8只大鼠，用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，于腹主动脉取血，立即行气管插管，支气管肺泡灌洗，收取支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，4℃，1 500 r/min离心10 min，弃上清，沉渣以lmL Hanks液缓慢重悬。取50μL细胞沉淀涂片，干燥固定，瑞氏染色显微镜下观察至少4个视野，且至少500个白细胞中EOS。

1.2.2 免疫组织化学法检测肺组织中IL-6的表达水平 收集各组大鼠右肺中叶，用10%甲醛溶液固定，肺组织切片经脱水、透明、浸蜡、包埋后制成4 μm组织切片，采用免疫组织化学法检测肺组织中IL-6的表达水平。肺组织胞浆出现棕黄色或褐色颗粒为阳性表达。采用400倍镜下观察，随机选取8个视野，用图像Pro-Plus分析软件进行灰度分析。

1.3 统计学处理 应用SPSS 17.0软件，计量资料以均数±标准差(¯x±s)表示，5组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用最小显著差数法t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 正常对照组大鼠未发现明显变化；其余各组OVA超声雾化吸入后，明显有烦躁不安、频繁挠鼻、呛咳、点头呼吸、呼吸急促现象。经连续激发后，大鼠活动明显减少，有的大鼠俯伏不动，体重不增长或增长缓慢，毛发的光泽度下降。地塞米松组大鼠仅个别见头面部瘙痒表现，其余大鼠均未见明显异常表现。

2.2 BALF中EOS 5组间BALF中EOS差异有统计学意义(F＝228.031，P＜0.001)。哮喘模型组EOS高于正常对照组，差异有统计学意义(t＝-13.169，P＜0.001)。神香草多糖低、高剂量组EOS明显低于哮喘模型组，差异均有统计学意义(t值分别为-8.192、12.610，P均＜0.001)。神香草多糖低剂量组EOS高于地塞米松组，差异有统计学意义(t＝12.547，P＜0.01)；神香草多糖高剂量组EOS与地塞米松组比较，差异无统计学意义(t＝0.256，P＝0.805)。见表1。

2.3 IL-6在大鼠肺组织中的表达 IL-6在胞浆表达，支气管纤毛柱状上皮细胞和浸润炎细胞出现阳性表达，肺泡间质也出现少量的表达(图1)。

图1 IL-6在大鼠肺组织中的表达

哮喘模型组IL-6水平高于正常对照组，差异有统计学意义(t＝23.634，P＜0.001)；神香草多糖低、高剂量组IL-6水平低于哮喘模型组，差异均有统计学意义(t值分别为14.576、12.251，P均＜0.001)；而神香草多糖低、高剂量组IL-6水平与地塞米松组比较，差异均无统计学意义(t值分别为 2.043、1.697，P均＞0.05)。见图2。

图2 各组大鼠肺组织中IL-6表达

3 讨论

神香草为唇形科植物硬尖神香草的干燥地上部分，主要产于新疆北部(阿尔泰地区)山区，是维吾尔医学常用药材。已在新疆维吾尔自治区人工种植成功，近年来引起国内外学者的广泛关注。研究表明，神香草精油具有解除支气管痉挛、镇咳作用，在减轻气道炎症反应和改善细胞因子的平衡方面也起到了重要的作用[7]。研究报道，维药神香草乙酸乙酯部位能明显降低哮喘大鼠血清中内皮素-1、IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，其呈剂量依赖性趋势，提示维药神香草可通过抑制IL-2、IL-6、TNF-α的分泌减轻哮喘的炎症反应[9]。Calin等[10]通过止咳实验、祛痰实验制备哮喘动物模型，分析维药神香草对哮喘相关指标表达水平的影响，为开发治疗哮喘的新药提供理论依据。

哮喘发病过程中的病理生理学改变与EOS的聚集、活化和脱颗粒密切相关，T淋巴细胞中EOS相互作用是哮喘发病的中心环节，主要靶细胞是Th2，诱发EOS炎症反应。哮喘发作时支气管肺泡灌洗液中有大量炎症细胞。本研究通过建立Wistar大鼠哮喘模型，从大鼠行为学改变证实建模成功。EOS是哮喘气道反应的主要效应细胞，其活性直接决定了哮喘发作和气道高反应的严重程度[11-12]。本研究采用OVA生理盐水雾化激发的方法制备大鼠哮喘模型，测定其BALF中EOS，结果显示哮喘模型组大鼠BALF中EOS明显升高，神香草低剂量组EOS与地塞米松组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，神香草高剂量组EOS与地塞米松组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，提示神香草多糖高剂量可减少肺内EOS浸润，改善肺功能。

IL-6是具有多种生物学活性的细胞因子，也是机体复杂的细胞因子网络中的关键因子，它可以调节其他细胞因子的作用。IL-6来源于单核细胞、活化的T细胞、B细胞、成纤维细胞、上皮细胞、膀胱癌细胞等，是一种具有复杂生理学功能的细胞因子，除参与机体的炎症反应和抗感染防御机制外，还与某些呼吸系统疾病的发生和转归密切相关。IL-6能够介导炎症反应，参与免疫调节，可平衡前炎症细胞因子或早期细胞因子的损伤效应[13-14]。IL-6在哮喘的病理学作用还不十分清楚。本研究通过免疫组织化学法对各组大鼠肺组织IL-6表达及定位、定量检测，发现IL-6在胞浆阳性表达，主要表达在肺组织、支气管上皮细胞和浸润的炎细胞。经灰度值测定后发现：哮喘模型组IL-6表达水平明显高于正常对照组；神香草多糖低、高剂量组IL-6表达水平均下降，以神香草多糖高剂量组IL-6水平下降明显，与哮喘模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.001)，而与地塞米松组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。提示神香草多糖高剂量对IL-6的作用与地塞米松相当，可以降低IL-6的表达，减轻哮喘的炎症反应。李玉秀和苗英慧[15]研究显示，支气管哮喘患者在哮喘急性发作期血清中IL-6、TNF-α的浓度均高于恢复期和正常对照组。提示细胞因子IL-6参与了哮喘的发病过程，检测其水平变化对探讨支气管哮喘的发病机制和预后评估具有重要的临床意义。

本研究以Wistar大鼠为研究对象，采用雾化吸入OVA致敏的方法制备大鼠哮喘模型，给予神香草多糖进行干预，神香草多糖可明显抑制哮喘大鼠IL-6的分泌，降低肺泡灌液中EOS，减轻哮喘大鼠的炎症反应。另外，Th1/Th2失衡是变应性哮喘发生过程中重要的免疫学特征性改变，主要表现为Th2数目增多和功能亢进[16]。本研究仅探讨Th2细胞因子IL-6在哮喘中的表达水平与作用，神香草是否能纠正Th1/Th2失衡、Th1在哮喘中的作用有待于更进一步的研究。

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The immunemechanism of Uygur medicine Hyssopus officinalis in asthmatic rats

XU Qian1，MA Xueping1，HE Jiayong2
(1.Department of Immunology，College of Preclinical Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi Xinjiang 830054，China；2.Department of Surgery，Staff-worker Hospital of Urumqi Petrochemical Subsidiary China National Petroleum，Urumqi Xinjiang 830019，China)

ObjectiveTo observe the effects of Uygurmedicine Hyssopus officinalis on interleukin-6(IL-6)and eosinophil(EOS)in asthmatic rats and to explore the mechanism of partial immunization of asthma.MethodsFifty healthy Wistar rats were randomly divided into normal control group，asthmatic model group，dexamethasone group，low dose Hyssopus officinalis polysaccharide group and high dose Hyssopus officinalis polysaccharide group.The negative normal control group was intraperitoneally injected with 1 mL sterile saline，the other four groupswere sensitized and induced asthma，the rats in treatment group were administered 1 mL per day(dexamethasone group with the concentration of 0.5 mg/kg，low dose Hyssopus officinalis polysaccharide and high dose Hyssopus officinalis polysaccharide group with 0.65 g/kg and 2.60 g/kg，resectively.After 1 week，at the end of excitation，each group were randomly selected 8 rats，bronchoalveolar lavage fluid (BALF)was collected for EOS.The expression of IL-6 in lung tissuesweremeasured by immunohistochemistry.ResultsThe EOS of BALF was statistically significant(P＜0.001).EOS in asthmatic model group was higher than that in the normal control group，the difference was statistically significant(P＜0.001).EOS counts in the low and high dose groupswere significantly lower than those inthe asthmaticmodel group(P＜0.001).EOS in low dose Hyssopus officinalis polysaccharide group was higher than that in dexamethasone group，the difference was statistically significant(P＜0.01). There was no significant difference in the EOS counts between the high dose group and the dexamethasone group(P＞0.05).The expression of IL-6 in cytoplasm，positive expression of IL-6 located in bronchial ciliated columnar epithelial cells and infiltrating inflammatory cells.The expression of IL-6 in the lung tissue of the asthma group was higher than that in the normal control group，the difference was statistically significant(P＜0.001).The expression of IL-6 in low dose group and high dose Hyssopus officinalis polysaccharide group was lower than that in asthmaticmodel group(P＜0.001).The level of IL-6 in the high and low dose group was slightly higher than that in the dexamethasone group，but the difference was not statistically significant(P＞0.05).ConclusionThe Hyssopus officinalis polysaccharide can inhibit the secretion of IL-6 and decrease the EOS content in BALF and relieve the inflammatory reaction in asthmatic rat.The polysaccharide of Hyssopusofficinalis may have a good anti-inflammatory effect.

Uygurmedicine；Hyssopus officinalis；Asthmatic；Immunemechanism；Interleukin-6(IL-6)；Rats

R291.5

A

2095-3097(2017)04-0203-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.04.003

2016-12-07 本文编辑：张在文)

新疆重大疾病医学重点实验室开放课题(SKLIB-XJMDR-2015-Y8)

830054新疆乌鲁木齐，新疆医科大学基础医学院免疫教研室(徐 茜，马雪萍)；830019新疆 乌鲁木齐，中国石油乌鲁木齐石化公司职工医院外科(贺家勇)

贺家勇，E-mail：29320508＠qq.com