鸡源Iss抗血清对鸡大肠埃希菌O2、O78、CVCC1551的抑制作用

咸富荣+温均皓+樊琛+徐旺烨+郑焕芹

摘要：为探讨Iss抗体对鸡大肠埃希菌（Escherichia coli）血清抗性的抑制作用，将纯化的Iss融合蛋白免疫雏鸡而获得抗血清，并对3株鸡大肠埃希菌株O2、O78、CVCC1551进行血清抗性抑制试验，分析Iss抗血清对鸡大肠埃希菌血清抗性的抑制作用。结果表明，抗血清对O2、O78、CVCC1551等3株致病性-血清抗性，但iss基因氨基酸序列不同的大肠杆菌均产生抑制作用，且抑制作用的程度与抗血清含量有关。

关键词：鸡大肠埃希菌（Escherichia coli）；Iss抗血清；抑制作用

中图分类号：S852.4；S831 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）14-2725-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.032

Abstract： To explore the inhibition of Iss antiserum to the Escherichia coli，the Iss fusion protein was purified and immuned to chickens. The serum resistances of 3 strains were detected after processed by antiserum and negative serum， the inhibition effect of Iss antiserum on E.coli serum resistance was examined. The results showed that Iss antiserum has the inhibition effect on the O2，O78 and CVCC1551，which were virulent-serum resistant stains，and the inhibition rate was related to content of antiserum.

Key words： avian Escherichia coli； Iss antiserum； inhibition

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）可引起人畜共患的細菌性传染病，病型复杂，其中危害最大的是急性败血型。大肠杆菌的毒力是由多种毒力因子共同作用的，包括黏附素、1型菌毛、毒素、外膜蛋白、ColV质粒、补体抗性、铁转运系统、宿主细胞表面改变因子等[1-4]。血清抗性可能受荚膜抗原、脂多糖和特定外膜蛋白调节，在多数菌株中表现出与毒力相关。iss基因编码的外膜蛋白可能通过调节细胞表面上对补体膜攻击复合体敏感的位点，导致表面排斥，使菌体具有抗血清补体溶菌能力[5-7]。

若能抑制菌株的血清抗性（补体抗性），降低菌株在血液中的存活和增殖能力，可减缓大肠杆菌病的进程，尤其是减少败血症的发生。本试验制备鸡源Iss抗血清，并探讨Iss抗血清对大肠埃希菌血清抗性的抑制作用，为大肠杆菌病的防制提供新的研究方向，并有利于食品安全的防控。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 CVCC1551、O78购于中国兽医药品监察所；O2为北京发病鸡场分离，经中国兽医药品监察所鉴定的强毒株，由东北农业大学预防兽医教研室170 mL/L甘油于-70 ℃冻存保存。其中CVCC1551、O2菌株iss基因序列一致，O78菌株核酸序列与O2的同源性99.4%，氨基酸序列同源性98%。

1.1.2 试剂 LB肉汤、麦康凯琼脂、大肠杆菌大肠菌群测试片购自青岛高科技园海博生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雏鸡致死试验 将待测大肠杆菌分别划板，挑取平板上的单菌落，将细菌置于LB液体培养基中37 ℃振荡培养过夜，离心，经PBS洗2次，并用PBS溶液倍比稀释。1日龄雏鸡买回后适应环境1 d，取0.2 mL稀释液经大腿肌肉注射2日龄雏鸡，约108 CFU/只，每组5只。连续观察7 d，每天计死亡数，并对死亡雏鸡进行剖检，取心、血、肝、脾于麦康凯平板上划线，检测大肠埃希菌感染情况[2，5]。

1.2.2 鸡源抗血清的制备 纯化的Iss融合蛋白0.1 mg与弗氏佐剂1∶1乳化[3]。14日龄雏鸡，皮下注射常规免疫。对照组注射PBS与弗氏佐剂乳化液[4]。四免7 d后加强免疫1次，5 d后取血，效价为1∶100，于-20 ℃保存备用。临用前56 ℃ 30 min灭活补体[1，2，8]。

1.2.3 Iss抗血清对菌株血清抗性抑制作用的检测 1∶100接菌于LB液体培养基中，按不同比例加入56 ℃ 30 min灭活鸡抗血清及对照组阴性鸡血清，37 ℃培养至对数期。取1 mL菌液8 000 r/min离心，0.6 mol/L NaCl溶液洗2次。0.9%生理盐水重悬混匀，倍比稀释。0.1 mL菌液加入0.5 mL生理盐水、0.4 mL新鲜血清混合，混合物于37 ℃温育。分别于0、 2 h取样，涂板计数，37 ℃培养18 h，计活菌数[1，3]。

试验组：Δlg=lg（2h）-lg（0h）；

对照组：Δlg=lg（2h）-lg（0h）；

抑制作用：ΔΔlg=Δlg（试验组）-Δlg（对照组）

以ΔΔlg的值为判定依据。若ΔΔlg<0，则说明Iss抗血清对菌株血清抗性有抑制作用；若ΔΔlg≥0，则说明Iss抗血清对菌株血清抗性无抑制作用[7]。

2 结果与分析

2.1 菌株致病力结果

由表1可见，O2、O78、CVCC1551三株菌株雏鸡致死率均为100%，属于致病性菌株，且3株菌株血清抗性较强[6]属血清抗性菌株。由此可知，3株菌株为致死性-血清抗性菌株。

2.2 抗血清对菌株血清抗性的抑制作用

56 ℃ 30 min灭活的鸡抗血清及对照组阴性鸡血清分别按1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000加入菌液，37 ℃培养至对数期。收获菌体，加入新鲜鸡血清检测试验组及对照组菌体血清抗性的差值ΔΔlg，结果见图1。由图1可见，当抗血清及阴性血清含量降低时，O2菌株ΔΔlg值增大，即抗Iss抗血清对细菌血清抗性的抑制作用越弱。抗血清及阴性血清加入比例为1∶10 000时，O2菌株ΔΔlg值为正值，说明此时抗血清对O2菌株的血清抗性已无明显抑制作用；加入比例为1∶10时，抗血清对菌株的血清抗性抑制作用最强，但此时抗性组的平板上菌落数过少，不利于控制误差。因此选择1∶10、1∶100比例进行后续试验。

按1∶10、1∶100加入抗血清及阴性血清，检测抗血清对菌株O78、CVCC1551的抑制作用（表2）。如表2所示，抗血清含量增加时，对菌株血清抗性抑制作用也增强。CVCC1551在加入1∶10抗血清时仍未显示抑制作用。但增加抗血清比例至1∶5时，抗血清显示出对菌株血清抗性的抑制作用，ΔΔlg值为 -0.017。抗血清对O2菌株血清抗性的抑制作用最强，其次为O78菌株，对CVCC1551的抑制作用最弱，并且此抑制作用随抗血清含量增加而增强。

3 讨论

根据抗血清对菌株血清抗性的抑制作用试验，在3株致病性菌株中，Iss抗血清对菌株血清抗性的抑制作用存在明显差异。抗血清对O2菌株血清抗性的抑制作用最强，其次为O78菌株，对CVCC1551的抑制作用最弱。菌株O78与其他2株菌株的氨基酸序列有差异，抑制作用居中，显示Iss抗血清对Iss氨基酸序列不同的菌株都可产生血清抗性的抑制作用。iss基因是高度保守的[9，10]，通常高度保守的基因在功能上也是较为重要的，并且具有制备亚单位疫苗，对动物产生免疫保护的潜力。本试验中Iss抗血清在抑制鸡大肠埃希氏菌的增殖中发挥了作用，但其作用机制还不清楚。可能是在细菌血清增殖的过程中减少了Iss蛋白的表达，因此降低了菌株的血清抗性。iss基因是编码大肠杆菌补体抗性的基因，iss基因编码的外膜蛋白可能通过调节细胞表面上的对补体膜攻击复合体敏感的位点，导致表面排斥，使菌株具有抗血清补体的融菌能力[5-7，9]。Iss抗血清对大肠埃希氏菌血清抗性的抑制作用越强，则表现为菌株的活菌数越少，ΔΔlg越小。試验表明，Iss抗血清的含量越大，对菌株血清抗性的抑制作用越强。樊琛等[5]在探究鸡源致病性大肠杆菌iss基因的原核表达中证实Iss抗血清可抑制鸡大肠埃希氏菌的血清抗性。但没有检测抗血清含量对此抑制作用的影响；也没有检测Iss抗血清对Iss氨基酸序列不同的菌株，在血清抗性的抑制作用上是否有选择性。本试验证实抗血清含量增高，抑制作用增强，且抑制作用对Iss氨基酸序列不同的菌株未显示特殊的选择性或专一性。

参考文献：

[1] 樊 琛，刘桂芹，王亚君，等.Iss蛋白在鸡源大肠杆菌不同毒力菌株中的检测[J].畜牧与兽医，2010，42（2）：71-73.

[2] 樊 琛，王亚君，李一经.iss基因与鸡大肠杆菌毒力相关性的分析[J].畜牧兽医学报，2005，36（1）：58-61.

[3] JOHNSON T J，GIDDINGS C W，HORNE S M，et al. Location of increased serum survivalgene and selected virulence traits on a conjugative R plasmid in an avian Escherichia coli isolate[J].Avian Dis，2002，46（2）：342-352.

[4] NOLAN L K，GIDDINGS C W，HOME S M，et al. Complement resistance，as determined by viable count abd cytan entic methods and its association with the presence of iss and the virulence of avian Escherichia coli[J].Avian Dis，2002，46（2）：386-392.

[5] 樊 琛，刘桂芹，王 宇，等.鸡源致病性大肠杆菌iss基因原核表达产物的免疫保护作用[J].畜牧兽医学报，2010，42（11）：84-86.

[6] 樊 琛，王 宇，王 会，等.一株O1血清型鸡大肠埃希菌iss基因的序列分析[J].动物医学进展，2009，30（11）：80-82.

[7] 李贵萧，朱宗涛，康燕青，等.鸡大肠杆菌的血清抗性与致病性检验[J].江苏农业科学，2015，43（11）：301-302.

[8] 牛明福，皇甫和平，王川庆.多杀性巴氏杆菌的血清抗性及毒力比较研究[J].上海畜牧兽医通讯，2003，30（1）：16-17.

[9] JOHN T J，SUBHASHINIE K，WANNEMUEHLER Y，et al. The genome sequence of avian pathogenic strain O1∶K1∶H7 shares strong similarities with human extraintestinal pathogenic genomes[J].Jouinal of Bacteriology，2007，189（8）：3228-3236.

[10] JOHNSON T J，WANNEMUEHLER Y，JOHNSON S J，et al. Comparison of extraintestinal pathogenic Escherichia coli strains from human and avian sources reveals a mixed subset representing potential zoonotic pathogens[J].Appl Environ Microbiol，2008，74：7043-7050.