肿瘤干细胞研究进展

喻敏成+徐泱

摘 要 近年来肿瘤干细胞正逐渐成为研究焦点。越来越多的证据表明肿瘤干细胞与肿瘤的形成、进展、转移、复发与治疗失败存在密切联系。本文主要就肿瘤干细胞假说的起源、上皮间充质转换、CD44与肿瘤干细胞的联系、肿瘤干细胞抵抗治疗的可能机制、肿瘤干细胞的信号通路及其治疗启示等五个方面展开论述。

关键词 肿瘤干细胞 上皮间充质转换 CD44 信号通路 肿瘤治疗

中图分类号：R730.231 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）15-0028-04

Research progress of cancer stem cells*

YU Mincheng**， XU Yang***

（Department of Liver Surgery， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China）

ABSTRACT Cancer stem cells （CSCs） have been the subject of intensive discussion and investigation for decades. Accumulated evidence indicates that CSCs play a crucial role in tumor initiation， propagation， metastasis， recurrence and therapy failure. In this review， we summarize the brief history of modern CSCs research， the importance of epithelial-to-mesenchymal transition in conferring CSCs properties， CD44 in CSCs as a promising biomarker and therapeutic target， the mechanisms by which CSCs may resist cancer therapy， signaling pathways involved in maintenance of the CSCs state and its clinical implications for cancer therapy.

KEY WORDS cancer stem cell； epithelial-to-mesenchymal transition； CD44； signaling pathway； cancer therapy

肿瘤干细胞（cancer stem cells， CSCs）假说提出肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中小部分具有干细胞性质的细胞亚群，并能通过不对称分裂，产生保留有相同性质的CSCs以及不同分化程度的、占肿瘤大部分的非致瘤性肿瘤细胞[1]。肿瘤内部的异质性是推动肿瘤进展、转移、复发以及影响肿瘤治疗和预后的可能原因。而CSCs假说则为解释肿瘤内部的异质性提供了一个新的思路。

1 CSCs概述

1937年Furth等[2]将小鼠单个白血病细胞移植到另一只近亲小鼠并成功导致其发生白血病，并提出不是所有的肿瘤细胞均具有致瘤能力。90年代Dick等[3]通过采用系列移植及荧光激活细胞分选技术首次在急性髓性白血病（AML）中证实了肿瘤内部存在等级分层，分离自AML患者的CD34++ /CD38-细胞亚群能在非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠模型中重新形成AML，从而为CSCs假说奠定基础。随后在乳腺、脑、前列腺、卵巢、结肠、肝脏、肺和胰腺等实体瘤中均发现了相应的CSCs，CSCs假说得到进一步完善。但上述异种移植实验反映的是肿瘤细胞的致瘤潜能而非真实的细胞命运决定。为克服肿瘤微环境改变对实验结果的影响，2012年3项独立研究通过采用谱系示踪技术分别追踪小鼠皮肤鳞癌、小肠腺癌、脑胶质瘤中的细胞命运，为肿瘤内部存在等级分层、CSCs具有干细胞特性即自我更新和多向分化形成整个肿瘤的能力提供了直接证据。

2 CSCs与EMT

2.1 EMT概述

上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）即上皮表型细胞转分化为间充质表型细胞的过程[4]。上皮性恶性肿瘤细胞经过EMT程序后能解除机体对抗肿瘤的防御机制、抑制凋亡、增加转移侵袭的能力，同时也是肿瘤耐药、肿瘤细胞群体扩充的来源之一。2005年Brabletz等[5]在研究结直肠癌进展时，发现肿瘤-宿主界面的肿瘤细胞同时表达“干性”相关基因和EMT相关基因，并将该肿瘤细胞称作“移行肿瘤干细胞”，提示CSCs与EMT之间存在联系。2008年Mani等[6]发现通过异位表达Twist和Snail转录因子激活EMT程序能使乳腺上皮癌细胞转变为CSCs样细胞（表达CD44+CD24-表型且具有體外成球的能力），且分离自乳腺上皮癌的CSCs表达EMT标志物。上述结果第一次为EMT和CSCs的产生提供了直接联系。现已在体内体外试验中证实很多其他上皮癌细胞中诱导EMT转录因子过度表达亦可产生CSCs的分子表型和功能上的特点[7]。同时，参与EMT调控的信号通路如Wnt、Notch以及Hedgehog同样也能推动CSCs的维持和自我更新。因此，激活EMT程序是肿瘤细胞获得、维持CSCs特性以及扩大CSCs池的分子基础。阻断EMT信号通路可成为以CSCs为靶向的一种抗肿瘤治疗方式。研究发现结直肠癌中PI3K/Akt/mTOR胞内信号转导通路组成性激活能使CD44v6表型的结直肠CSCs表达EMT相关基因，抑制PI3K通路则能选择性杀伤CD44v6表型的结直肠CSCs以及降低肿瘤的转移生长能力。b-catenin是直接参与诱导EMT的转录因子，一些临床试验通过应用BMPs拮抗b-catenin的激活来抑制结直肠CSCs中的EMT基因，从而促进结直肠CSCs的分化、凋亡以及对化疗药物敏感。另外，用ROR1特异性单克隆抗体能抑制CSCs中EMT相关基因的表达降低卵巢癌小鼠中的转移灶。

2.2 miRNA对EMT及CSCs的调控

miRNA是造成肿瘤异质性的来源之一，对EMT以及CSCs均具有一定的调控作用。miR200-ZEB1轴被认为是参与EMT调控的核心机制之一[4]，miR-200家族成员能通过抑制转录因子ZEB1/2的表达进而抑制EMT。此外研究发现miR-200家族成员亦能通过抑制Bmi-1的表达有效抑制EMT以及肿瘤的远处转移。Bmi-1与EMT转录因子Twist-1在诱导EMT过程中互为必须。Bmi-1作为HH信号转导通路下游的转录因子，对调节CSCs的自我更新同样至关重要。研究发现miR-200家族成员能抑制乳腺癌中CSCs的形成，反之乳腺CSCs中miR-200家族成员大幅下调。因此miR-200参与EMT和 CSCs的共同调控。同样，miR-34和Let-7也有相似调控作用：miR-34能直接参与胰腺CSCs自我更新的调控，对细胞命运决定有重要作用。而miR34-SNAIL1轴作为非编码RNA参与EMT调控的另一核心机制[4]，miR-34也能通过作用于SNAIL抑制上皮肿瘤细胞的EMT程序。Let-7能调控乳腺肿瘤细胞的自我更新以及成瘤能力。口腔鳞癌中，Lin28/Let-7轴能诱导“干性”基因如Oct4/ Sox的表达调控CSCs，同时，let-7d也能抑制EMT程序。对吉西他滨耐药（GR）的胰腺癌细胞常获得间充质表型，且具有自我更新的特性，研究发现该细胞中let-7家族的表达大幅下调。上述研究均提示miRNA可能是连结EMT与CSCs的枢纽。此外，近年研究显示miRNAs、EMT以及CSCs均参与肿瘤细胞耐药的调节[8]。因此以miRNAs为靶点的抗肿瘤治疗是使耐药肿瘤细胞重新对化疗敏感的一种可行治疗方式。

2.3 肿瘤微环境对EMT和CSCs的调控

肿瘤细胞EMT程序的激活大多来自肿瘤微环境中的刺激，这些刺激主要分为五类：低氧和低pH；固有和适应性免疫应答；机械应激；细胞外基质（extracellular matrix， ECM）改变以及抗肿瘤药物的使用[9]。肿瘤细胞对低氧的应答主要由HIFs转录因子家族介导。低氧/ HIF-1轴作为多条信号通路的枢纽，共同参与EMT与CSCs的调控[10]。低氧能通过稳定和/或表达HIF-1a亚基使HIF-1活化，活化后的HIF-1最终能诱导多个EMT主转录因子如Twist、Snail、Slug、ZEB1/2的表达从而激活EMT程序。多个研究发现参与CSCs状态维持的信号通路如Notch、Wnt/b-catenin、TGF-b等在低氧/HIF-1诱导的EMT中具有重要作用[8]。CSCs“巢”（niche）是位于肿瘤微环境中的一个特殊的解剖學区域，对调控CSCs的命运决定至关重要[11]。低氧作为CSCs巢的特点现已在多个肿瘤类型中得到证实[8]。低氧能通过激活HIF-1诱导Oct-4、Sox-2、Nanog、Myc、CD44和CD133等多个CSCs相关基因的表达，同时也能提高肿瘤细胞自我更新以及成瘤能力。体内敲除实验发现CSCs的存活需要HIF-1，体外实验中HIF-1的活性降低则能使CSCs失去成瘤能力。HIF-1a还能通过拮抗c-Myc减慢细胞周期进展，保护CSCs免受DNA损伤以及增加细胞干性。上述研究结果均提示低氧/HIF-1轴是扩大并维持CSCs群体的机制之一。另外，HIF-1还与ROS的产生及激活密切相关。低氧条件下，肿瘤细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species， ROS）含量增加，ROS激活的应激反应通路以及ROS参与诱导的TGF-b和TNF-a通路能共同促进EMT程序以及CSCs生存。因此以HIF-1作为抗肿瘤治疗的靶点，理论上来说，不仅可抑制EMT程序，同时能通过促进CSCs分化从而减少CSCs群体。

值得注意的是，EMT程序的激活并非微环境刺激直接作用的结果，而是以自分泌或旁分泌因子作为胞外介质介导的肿瘤细胞、肿瘤相关细胞与肿瘤基质之间的相互作用。因此肿瘤微环境中肿瘤相关细胞也参与诱导EMT程序[9]。这些细胞不仅包括占肿瘤基质绝大部分的纤维细胞和成肌纤维细胞，还包括与炎症及愈合相关的细胞[12]。有趣的是，部分上述细胞如成肌纤维细胞、间充质干细胞（MCSs）及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）也可同样通过激活干细胞相关基因参与CSCs的形成与维持[13]。因此肿瘤微环境的作用进一步提示EMT程序的激活与CSCs存在密切联系。

3 CSCs与CD44

CD44是单跨膜糖蛋白家族中的一员，结构和功能各异。现已证实CD44是一个典型的CSCs表面标志物，单独或与其他标志物如CD24、CD133和CD34等联合使用，可用于富集多种类型肿瘤的CSCs。近年来研究发现相比于CD44s亚型，CD44v亚型作为CSCs标志物更为适用[14]。CD44可通过抑制PKM2活动或稳定xCT这两种途径诱导CSCs进入抗氧化状态（GSH增加，ROS降低），进而阻止ROS诱导的肿瘤细胞衰老、凋亡或分化[15]。因此，CD44也可成为清除CSCs群体的治疗靶点。有关以CD44为靶向的治疗方式一方面可基于抗CD44抗体的使用，另一方面可通过阻断透明质酸与CD44结合，抑制肿瘤的生长和转移。另外，CD44也可作为肿瘤的预后标志物。2014年一项荟萃分析发现，胃癌中CD44的表达与TNM分期、淋巴结、远处转移和总体生存率降低有关。同样，CD44也可作为肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、头颈癌、咽下鳞癌等肿瘤的预后标志物[14]。然而，值得注意的是CD44的预后价值在不同肿瘤中存在差异，CD44的表达并不一定意味着肿瘤进展的可能性增加。如一项研究显示侵犯至浆膜下层的结直肠癌细胞CD44表达缺失却能够很好的预测远处淋巴结以及肝脏的转移。综上所述，CD44尤其是CD44v亚型参与调节CSCs多方面性质，包括自我更新、成瘤能力、远处转移和化疗抵抗。因此既可作为清除CSCs的治疗靶点，又兼具肿瘤的诊断价值和预后价值。

4 CSCs与治疗抵抗

4.1 ABC转运子

通过流式细胞术分选出具有快速排出荧光染料Hoechst33342能力的细胞称之为侧群细胞（side populations）。由于侧群细胞具备自我更新及体外成瘤等CSCs性质，现已被广泛应用于CSCs的分离与鉴定。参与上述药物模拟染料排出的ABC转运蛋白家族是CSCs多药耐药的重要机制之一，其中研究得较为广泛的主要有ABCB1（MDR1）、ABCC1（MRP1）、ABCG2（BCRP）。它们能依赖ATP将胞内多种化疗药物如紫杉烷类、拓扑异构酶类抑制剂以及抗代谢物泵出，使胞内药物浓度低于细胞毒性水平。研究显示CSCs高表达上述ABC转运蛋白家族[16]。如PTEN/PI3K/Akt信号通路可调控人和小鼠神经胶质瘤CSCs表达ABCG2转运蛋白，使之对神经胶质瘤一线用药替莫唑胺耐药。

4.2 ALDH

在很多类型肿瘤中，醛脱氢酶（ALDH）被认为是CSCs的主要标志物。ALDH的活性提高与CSCs的放化疗抵抗有关，ALDH介导的治疗抵抗包含多个复杂机制。ALDH催化醛磷酰胺氧化生成羧基磷酰胺的过程是环磷酰胺等化疗药物的主要解毒机制。ALDH在氧化应激反应中能直接清除放疗诱导产生的自由基或产生抗氧化剂NAD（P）H。此外，ALDH的活性还与激活PI3K/AKT和MAPK/ERK促生存信号通路有关。最近一项研究显示用全反式维甲酸（ATRA）抑制ALDH的活性能诱导头颈鳞状细胞癌CSCs的分化和增加对放疗的敏感性。

4.3 DNA的损伤修复

放疗及大多数化疗药物能通过诱导DNA损伤导致肿瘤细胞死亡，而多项证据表明CSCs能保护自身免受DNA损伤的影响。放疗可使肿瘤细胞过度产生ROS最终损害包括DNA在内的关键分子。研究显示在乳腺癌和胃肠肿瘤中，与非CSCs相比，CSCs具备更为高效的ROS清除系统及更低水平的ROS。放化疗后DNA损伤监测蛋白和修复蛋白如ATM、Chk1/2、p53、BRCAs以及XRCC5只在CSCs中异常激活或过度表达[17]，使用ATM或Chk1抑制剂可分别使乳腺癌CSCs对放疗敏感或使胰腺癌CSCs对化疗药物吉西他滨敏感。同时，放疗还能延长CSCs分裂周期增加DNA修复时间。因此，上述研究结果提示CSCs主要通过调控细胞周期状态；提高DNA损伤修复能力以及高效清除ROS三种机制抵抗DNA损伤。

4.4 其他机制

大多数CSCs处于相对静止或休眠状态，因此对以快速增殖细胞为靶点的化疗方式不敏感。上皮性肿瘤细胞经过EMT程序后（获得CSCs）通常对治疗方式具有更强的抵抗能力，部分通过表达耐药相关基因[4]。过度表达促生存通路如Wnt、Notch、Hedgehog等同樣能增加CSCs抵抗放化疗的能力。放化疗也可通过激活CSCs自噬作用以维持代谢稳态和提高恶劣环境下的生存能力。如前所述，CSCs存在于肿瘤微环境中的特殊区域，CSCs巢同样也是导致CSCs治疗抵抗的原因之一。

5 CSCs与靶向治疗

Wnt、Notch以及Hedgehog这三条通路是原始的、进化上高度保守的细胞命运决定信号通路，CSCs的特点包括上述一条或多条信号通路的持续性激活[18]。这些为CSCs提供支持的关键信号通路为精确分子治疗提供了潜在的靶点。

5.1 wnt通路相关的靶向药物

除FDA已批准的Wnt通路非特异性抑制剂如非甾体类抗炎药物以及维生素类衍生物外，许多靶向药物均已进入早期临床试验[19]。小分子类抑制剂如ICG-001及第二代复合物PRI-724，能与CREB结合蛋白（CBP）特异性结合阻断CBP依赖性基因表达；LGK974作为Porcupine酶抑制剂现已进入临床一期实验，可以阻断Wnt配体的脂质化修饰和分泌。单克隆抗体类药物如OMP-54F28能通过结合Fzd8受体的配体阻断Wnt信号通路，OMP-18R5则能通过结合至少5个Fzd受体直接阻断Wnt信号通路。但至今没有能特异性有效靶向该信号通路的药物上市。Wnt信号通路在进化上高度保守，有关该通路的靶向治疗常因其关键成分在其他功能方面具有冗余性而变得困难。如b-catenin作为潜在治疗靶点，同样能与E-cadherin相互作用参与细胞黏附。另外，该通路还与多个参与细胞稳态维持的关键功能有关，这意味着有关该通路的靶向治疗会带来潜在的严重不良后果如胃肠道毒性、贫血以及免疫抑制等[20]。

5.2 Notch信号通路相关的靶向药物

在众多特异性靶向Notch通路关键成分的单克隆药物之中，demcizumab（OMP-21M18）和tarextumab（OMP-59R5）是现今临床试验级别最高的药物（均已进入临床二期试验）。研究发现有关抗Dll4单克隆抗体demcizumab的作用机制主要来自三个方面：抑制功能性肿瘤血管生成、减少CSCs的数量以及调节抗肿瘤的免疫反应。另一类小分子抑制剂如g-分泌酶抑制剂（GSIs）同样也进入了早期临床试验，其作用机理为抑制Notch受体的最后一步裂解。然而GSIs有关的临床研究进展受到治疗相关毒性尤其是胃肠道严重不良反应的阻碍[21]。

5.3 Hedgehog信号通路相关的靶向药物

临床前期试验显示与Hh通路有关的靶向治疗方式能阻断CSCs相关的耐药、转移和复发[22]。阻断Hh信号通路的机制包括抑制SMO、中断受体配体间相互作用、阻断配体的形成过程以及抑制GLI。其中，SMO抑制剂对包含SMO或PTCH变异的成神经管细胞瘤和基底细胞癌尤其有效。环巴明（cyclopamine）作为自然发生的SMO抑制剂因效价强度和生物利用度不高限制其进一步的临床使用。目前Hh通路靶向药物中临床级别最高的是SMO抑制剂vismodegib，2012年经FDA批准用于转移性BCCs和原发BCCs已不适合手术或放疗的病人。但该药物在其他的肿瘤应用中却极为有限，其可能原因在于早期试验缺乏对病人分层、Hh通路与其他致癌基因信号通路相互作用以及对大多数CSCs的Hh信号通路激活机制缺乏了解。

綜上所述，CSCs假说为肿瘤传统治疗方式的失败提供了解释。虽然以CSCs信号通路为靶向的治疗富有前景。但信号通路之间存在的相互作用给以CSCs为靶向的治疗方式带来了挑战和机遇。一方面意味着靶向单个信号通路将导致多个信号通路级联阻滞。另一方面这同样也成为CSCs逃避治疗的机制之一（上调相关的互补通路）。因此联合用药和适合的病人等级分层是可能的解决方式之一。

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