L—谷氨酰胺对麻疯树再生不定芽生根效果的影响

刘颖 唐家年 黄川腾 刘国选 林诗婉 高美芳 吴东霖 陈建平

摘要 [目的]建立促进麻疯树再生不定芽生根的组培体系。[方法] 通过在诱导麻疯树再生不定芽分化生根的培养基（MS+0.3 mg/L IBA）中添加一定浓度的L-谷氨酰胺（Gln）来达到促进芽条生根的效果。[结果] 在诱导麻疯树再生不定芽分化生根的培养基中添加20 mg/L Gln，可以显著提高芽条的生根率，生根率可达40%～50%。同时，可以在短时间内就获得较高的生根率，显著縮短了获得完整植株的周期。此外，还减少了生根过程中常见的再生植株叶片发黄、容易脱落现象的发生，显著提高了所获得的再生完整植株的质量。[结论] 麻疯树生根培养基的最优组合为添加0.3 mg/L IBA和20 mg/L Gln的MS培养基，应用该研究建立的组培体系可显著改善麻疯树再生不定芽的生根效果。

关键词 麻疯树；L-谷氨酰胺；再生不定芽；生根

中图分类号 S184；Q949.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）07-0125-05

Effect of L-Glutamine on the Rooting of Regenerated Shoot Buds of Jatropha curcas

LIU Ying1，TANG Jia-nian1，HUANG Chuan-teng2，CHEN Jian-ping3* et al （1.Faculty of Agricultural Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088；2.Hainan Provincial Forestry Institute，Haikou，Hainan 571100；3.Faculty of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088）

Abstract [Objective] To establish a tissue culture system for promoting rooting of regenerated buds of Jatropha curcas.[Method] L-glutamine （Gln） was added into rooting medium （MS+0.3 mg/L IBA） for improving the rooting efficiency of regenerated buds of J.curcas.[Result]When 20 mg/L Gln was supplemented into rooting medium，the rooting efficiency of regenerated shoot buds could be significantly increased （raised up 40%-50%）.In addition，satisfactory rooting rate was obtained in a short time （10～20 days），and the cycle of gaining a complete plant was shortened significantly.Moreover，reducing the chances of this happening that the leaves were easy to be yellowing and fall down from regenerated plants in the process of rooting，and then the quality of regenerated whole plants was obviously improved.[Conclusion] The optimal combination of rooting medium was MS medium supplemented with 0.3 mg/L IBA and 20 mg/L Gln.The rooting effect of regenerated buds of J.curcas could be significantly enhanced via application of the tissue culture system established in this study.

Key words Jatropha curcas；L-glutamine；Regenerated shoot buds；Rooting

麻疯树（Jatropha curcas L.）又名小桐子、黄肿树，为大戟科（Euphorhiaceae）麻疯树属（Jatropha）多年生的落叶灌木或小乔木[1]。麻疯树原产于中美洲，主要分布于热带和亚热带地区[2]，在我国主要生长在四川、云南、贵州、广东、广西、海南和台湾等省（区）。麻疯树组织提取物中的毒蛋白、麻疯酮等活性成分可以被开发为药物，常用于消肿散淤、清热解毒等，近年来还发现这些物质具有显著的抗癌活性[3-4]，还可用于生物病虫害防治[5]。麻疯树种子含油量高达40%～60%，提取的种子油可用于生产优质的“生物柴油”[6-8]，有利于缓解当前全球石油能源短缺的问题。麻疯树被认为是一种重要的可再生能源，受到世界各国科学家的广泛关注[7-8]。然而，麻疯树生长区域有限以及种子产量低限制了麻疯树生物柴油产业化的发展。通过遗传改良可以提高麻疯树种子含油量以及改變油脂的组分，增强麻疯树的抗病害能力和对环境的适应能力，扩大其种植面积[9]。

目前，植物遗传改良主要是采用农杆菌介导的遗传转化，但是进行此类遗传转化，需要一个良好的植株组织培养再生体系。植物组织培养技术在麻疯树的遗传改良和良种繁育方面得到了广泛应用。现已建立起来的诱导麻疯树再生不定芽生根的方法仍然存在芽条生根效率低、再生不定根的质量较差、所获得再生植株生长状态不佳、整个培养周期较长等缺点，难以满足实际应用的需要。

L-谷氨酰胺（Gln）是一种在植物生命活动中起着重要作用的氨基酸。它是构成蛋白质的基础氨基酸，又是合成含氮生物物质的氮源，与组织生长和发育有着密切的关系。在不同植物组织中Gln具有不同的代谢作用，起着非常重要的生理作用。Gln常常被当作有机氮源应用于植物组织培养[10]。许多研究结果表明，培养基中添加适宜浓度的Gln可以改善外植体的再生效果[11-13]。还有研究報道，培养基中添加一定浓度的Gln可能会对一些植物再生不定芽的生根产生积极作用[14-16]。截至目前，关于Gln对麻疯树再生不定芽分化生根影响的研究鲜见报道。该研究通过添加一定浓度的Gln来考察其诱导麻疯树再生不定芽生根效率的影响，为解决麻疯树再生不定芽生根困难提供一种方法。

1 材料与方法

1.1 植物材料

研究采用的麻疯树种子（M-19）均采自海南省海口市东山林场[17]。将这些种子剥壳后进行表面灭菌，在培养基上进行12 d萌发培养后，从实生苗上获得子叶叶柄外植体[18-21]。

1.2 试验方法

1.2.1 Gln母液的配制。准确称取一定量的Gln粉末，用去离子水充分溶解后，再用去离子水定容，配制成2 mg/mL的Gln母液。使用前用0.22 μm的水系滤膜对已配制好的Gln母液进行过滤灭菌。

1.2.2 培养基及培养条件。

该研究所有试验都是在相同培养环境下进行。培养基均使用1 mol/L NaOH溶液调整pH至5.8～6.0，然后在121 ℃，0.1 MPa的条件下高压灭菌20 min。组织培养室培养条件为光照强度2 000 lx、光照时间12 h/d和培养温度（25±1）℃。在无特殊说明情况下，所用培养基均添加了100 mg/L肌醇、3%蔗糖和0.6%琼脂。

1.2.3 麻疯树再生不定芽的获取。采用实验室已报道的方法[18-21]，利用高浓度TDZ溶液诱导麻疯树子叶叶柄外植体再生不定芽，从而获得大量优质的麻疯树再生不定芽，然后将带有再生不定芽的外植体接种至添加了0.5 mg/L BA（苄氨基腺嘌呤）、0.2 mg/L KT（激动素）、0.4 mg/L GA3（赤霉素）和0.2 mg/L IAA（吲哚乙酸）的MS培养基上进行15 d不定芽伸长培养，之后从培养瓶中取出高度大于1 cm且至少有2个伸展叶片的不定芽外植体，用灭过菌的手术刀对伸长的再生不定芽进行横向切割，切去其他部分，只保留长度约为1 cm的不定芽芽条。注意切割的方向与伸长的再生不定芽的中轴相垂直，切口平齐。

1.2.4 麻疯树再生不定芽生根培养。

1.2.4.1 采用传统方法诱导麻疯树再生不定芽生根。将获取芽条以竖插方式（使芽条的中轴与培养基表面相垂直，芽条的形态学下端插入培养基中的深度为0.2～0.4 cm）接种至6种传统生根培养基上进行生根培养，培养10、20、30、40 d后分别统计再生不定芽的生根情况[22]。

6种生根培养基分别为无激素MS培养基[23]，无激素1/2MS培養基[24]，添加了3.0 mg/L IBA（吲哚丁酸）、1.0 mg/L IAA和1.0 mg/L NAA（萘乙酸）的1/2MS培养基[25]，添加了0.1 mg/L IAA的MS培养基[24]，添加了1.0 mg/L NAA的1/2MS培养基[23]，添加了0.5 mg/L IBA的1/2MS培养基[26]。

1.2.4.2 采用在培养基中添加Gln的方法诱导麻疯树再生不定芽生根。将获取芽条以竖插方式（使芽条的中轴与培养基表面垂直，芽条的形态学下端插入培养基中的深度为0.2～0.4 cm）分别接种至添加了0、5、10、20、40、80、160 mg/L Gln和0.3 mg/L IBA的MS培养基上进行生根培养，培养10、20、30、40 d后分别统计再生不定芽的生根情况。

1.2.5 麻疯树再生植株的驯化移栽。

从培养瓶中小心取出麻疯树再生小植株，在自来水下洗去植株根部所带有的培养基后，将其种植在已经灭菌的培养基质（土∶沙砾=1∶1）中，保鲜膜覆盖保湿培养14～21 d后，将植株移栽至盛有土壤的培养盆中继续生长。

1.2.6 试验结果记录与数据处理。该研究所有试验处理均重复3次，每个重复包括30个外植体，试验数据均用3次重复的平均值±标准差（SD）表示。数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较。

2 结果与分析

2.1 采用传统方法诱导麻疯树再生不定芽生根的效果

将获取芽条以竖插方式接种至6种传统生根培养基上培养，分别在培养10、20、30和40 d后进行生根效果统计。由表1可知，在6种诱导芽条生根培养基中，诱导芽条生根效果最好的是添加了0.5 mg/L IBA的1/2MS培养基，芽条在这种培养基上培养40 d后，生根率为18.07%，平均每个芽条上的根数为2.61条，平均根长为2.27 cm，都为最大值；而培养30 d后，其生根率为16.15%，平均每个芽条上的根数为2.56条，平均根长为2.14 cm（图1Ⅵ），所获得的结果与40 d时都没有差异显著性。因此为了缩短培养时间，更快地获得再生植株，采用30 d的培养时间为宜。芽条在无激素培养基（MS和1/2MS）中都不能产生不定根（图1Ⅰ和Ⅱ），而在添加较高浓度生长素的培养基（1/2MS+3.0 mg/L IBA+1.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA、1/2MS+1.0 mg/L NAA和1/2MS+0.1 mg/L IAA）上生根率较低（图1Ⅲ～Ⅴ），这说明添加过高浓度的生长素会对芽条生根产生一定的抑制作用。此外，在试验过程中还发现，采用常见生根培养基来诱导麻疯树再生不定芽生根，培养后所获得完整植株上的叶片容易发黄甚至脱落。

综上所述，采用传统方法诱导麻疯树再生不定芽生根的效果不佳，存在生根率较低、培养周期较长、生根质量较差、难以获得生长状态良好的再生植株等问题。

2.2 Gln对麻疯树再生不定芽生根效果的影响

将获取芽条以竖插方式接种至添加了0.3 mg/L IBA和0、5、10、20、40、80、160 mg/L Gln的MS培养基以及2组对照培养基CK1（无激素MS培养基）和CK2（仅添加20 mg/L Gln的MS培养基）上培养，培养10、20、30、40 d后分别统计再生不定芽的生根情况。由表2可知，在未添加Gln的生根培养基中，诱导芽条生根的效果较差，生根率最高为21.52%；而在添加Gln的生根培养基中，随着添加Gln的浓度提高，芽条生根率先增加，到20 mg/L时，芽条的生根效果最佳，生根率最高为49.32%，平均每个芽条上的根数最多为6.52条，平均根长最长为5.15 cm，继续提高Gln的浓度，芽条的生根效果变差，生根率降低，到160 mg/L时，生根率最高仅为13.62%，平均每个芽条上的根数最多为2.02条，平均根长最长为2.18 cm。由此可见，在培养基中添加Gln的浓度太低或者太高都不利于芽条不定根再生，Gln的最适添加浓度为20 mg/L。

培养时间为10 d时，芽条在添加10～40 mg/L Gln的生根培养基中，生根率为23.36%～29.31%，特别是在添加了20 mg/L Gln的生根培养基中芽条的生根效果最佳，生根率最大为29.31%，平均每个芽条上的根数为2.26条，平均根长为1.32 cm（图1Ⅶ）；而此时芽条在未添加Gln的生根培养基中的生根效果不佳，生根率仅为8.53%，平均每个芽条上的根数为1.32条，平均根长为0.65 cm。随着培养时间的延长，芽条的生根率也逐渐增加，然而当培养时间达30 d后，继续增加培养时间，芽条的生根率并没有显著增加（图1Ⅷ）。

此外，芽条在无激素MS培养基上不能再生出不定根，并且芽条的生长状态不佳，叶片易发黄；而在只添加了20 mg/L Gln的MS培养基上生根效果也非常差，生根率最高仅为12.32%，平均每个芽条上的根数为1.67条，平均根长为1.79 cm，此时芽条的生长状态也不好，叶片难以继续伸展（表1、2）。

综上所述，麻疯树再生不定芽在添加20 mg/L Gln的培养基中的生根效果显著优于传统方法，且在较短时间内（10 d）就可以达到较好的生根效果，生根率最高为29.31%，最后还可以获得生长状态良好的再生植株（图1Ⅸ）。

3 结论与讨论

麻瘋树再生不定芽条存在生根难的问题，严重阻碍了其组培再生和遗传转化的研究进展。生长素是诱导芽条生根的强效激素[27-28]。IBA是一种常见的生长素，常被用于诱导再生不定芽生根。在对麻疯树叶柄外植体再生不定芽进行生根诱导时，IBA也是一种常见的生长素，常被用于诱导芽条不定根再生[29-30]。该研究结果表明，虽然麻疯树再生不定芽在添加0.3 mg/L IBA的培养基中可以形成不定根，但是生根效果较差，生根率最高仅为22.76%。进一步观察发现，伸长芽条上的叶片容易发黄甚至脱落，并且这种现象经常发生在将麻疯树再生芽转移至生根培养基中进行生根诱导培养时[31-32]。

Gln作为一种参与植物新陈代谢的重要内源性氨基酸组分，是合成生物体内极其重要的抗氧化剂还原型谷胱甘肽的前体物质，是构成蛋白质中氨基酸和合成含氨生物物质的氮源，与组织生长和修复有密切的关系，在生命活动中起重要作用[33]，并且常常被当作一种有机氮源添加到植物组织培养的培养基中[10]。有很多研究表明，在培养基中添加Gln可以提高外植体的再生效率和外植体的生物量[34-36]。氮的浓度和铵态氮与硝态氮的相对含量可能对植物细胞的生长和形态建成起着至关重要的作用[37-38]。虽然使用添加了氨基酸或者水解蛋白的培养基来促进外植体增殖的报道比较常见，但是氨基酸是如何影响离体器官发生的机理还不清楚。还有些研究结果表明，在培养基中添加Gln可以影响多种植物再生不定芽的生长效果，如Kaur等[39]在诱导儿茶[Acacia catechu（Linn.f.） Willd]再生不定芽生根時发现，在培养基中添加150 mg/L Gln，可以明显缓解芽条上叶片易发黄和脱落的现象，但是并没有探究Gln对芽条生根效率的影响。

该研究结果表明，麻疯树再生不定芽在未添加IBA的MS培养基上没有不定根再生发生，而在添加了IBA的培养基上有不定根发生，说明IBA对于芽条再生不定根发生可能是必须的，然而芽条在只添加了0.3 mg/L IBA的培养基上虽然可以生根，但是生根效果较差，叶片容易发黄甚至脱落；如果在添加了0.3 mg/L IBA的1/2MS培养基中再添加一定浓度的Gln，芽条的生根效率会有显著提高并且叶片可以保持鲜绿，但是芽条在仅添加20 mg/L Gln而没有添加IBA的MS培养基上的生根效果非常差，由此可以说明Gln对芽条生根具有促进作用并且芽条上叶片生长的改善作用可能是由于Gln与IBA的协同作用所产生的效果。

此外，该研究还发现采用传统方法对麻疯树再生不定芽进行不定根诱导时，对芽条的质量要求较高，一般是要求芽条的长度至少达2 cm，带有3～4个叶片[40-41]，这在一定程度上减少了可以用于进行生根培养的芽条数量，因而会减少获得完整再生植株的数量；而采用在生根培养基中添加适宜浓度Gln的方法可以促使质量较差、长度约为1 cm且只带有2～3个叶片的芽条生根，这在一定程度上提高了可以用于生根培养的再生不定芽的利用效率，最终可以增加获得完整再生植株的数量。如果将此方法应用于麻疯树的遗传转化，可能会提高获得完整转化苗的效率。在试验过程中还发现，添加了适宜浓度Gln的试验组中的芽条培养30 d后，不仅生根效果良好，所获得再生植株的生长状态也良好，叶片鲜绿。另外，对于那些没有生根的芽条还可以将其接种至添加了20 mg/L Gln的生根培养基上进行再次生根培养，这样可以提高芽条的利用效率，增加完整再生植株的数量。

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