土壤特征对黄花蒿酚类物质的影响

邸胜娟 罗世琼 杨占南 郑筑 胡娟 赵铖

摘要：为探索影响黄花蒿酚类组分累积的土壤因素，测定了黄花蒿东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量及土壤养分含量、酶活性、微生物标记性磷脂脂肪酸（PLFAs）含量，并对其进行相关性及因子分析。结果表明，不同样地黄花蒿东莨菪内酯含量、猫眼草酚含量、猫眼草黄素含量、根际土壤养分含量、酶活性及微生物PLFAs含量存在差异；土壤有效磷含量与东莨菪内酯含量呈显著正相关（P<0.05），与黄花蒿猫眼草酚、猫眼草黄素含量呈极显著正相关（P<001）；速效钾含量与猫眼草黄素含量呈显著正相关（P<0.05）；有速效钾、有效磷是影响黄花蒿东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量的主要因子。人工栽培黄花蒿可结合当地土壤实际状况，适量增施磷肥与钾肥，可促进黄花蒿东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量的增加，这为人工栽培黄花蒿，提高黄花蒿的品质提供了科学的理论依据。

关键词：黄花蒿；酚类物质；养分；酶活性；磷脂脂肪酸

中图分类号： S567.21+9.06文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）11-0085-05[HS）][HT9.SS]

黄花蒿（Artemisia annua L.） 为菊科蒿属一年生草本植物，具有重要的医药功能，作为中药材已有上千年的历史[1]。例如，从黄花蒿叶中分离提取的青蒿素被世界卫生组织列为治疗疟疾的首选药物[2]。受不同生长环境如气候、土壤等因素的影响，黄花蒿药效组分含量差异明显（青蒿含量 001%～1.50%，总多酚含量56～530 mg/g）[3]。目前，有关产地、生长阶段、施肥等因素对黄花蒿药效组分的影响已有文献报道[4]，黄花蒿主要挥发性组分随不同产地及种植环境不同而差异显著[5]；黄花蒿叶片中青蒿素含量在花蕾前期最高，随着生长时间的延长，其含量反而降低[6]；施肥对黄花蒿抗疟相关组分有一定的影响[7]。然而，关于土壤条件对黄花蒿酚类物质影响的报道较少。黄花蒿药效组分含量总是受到生长环境的影响[8]，其土壤条件是一个重要的影响因素，因为土壤与植物根系复杂的物理、化学及生物过程，必然影响养分、酶活性及微生物特征[9-13]，从而影响黄花蒿根系对养分的吸收，进而影响黄花蒿药效组分的含量。因此，研究土壤环境因素对黄花蒿药效组分的影响，对提高其药效组分含量，实现提高其药材品质具有重要意义。

我国野生黄花蒿资源豐富，尤以西南地区品种最多，分布面积较大。有报道指出，位于亚热带季风气候区的贵州、广西、重庆和湖南等地适宜野生黄花蒿的人工种植[14]。研究证实黄花蒿酚类物质包括东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素，该类物质具有协同青蒿素提高其抗疟和抗癌作用，并具有较高的抗氧化活性[15]。黄花蒿酚类组分含量的变化引起了人们的广泛关注。本试验采样地点选择气候条件基本一致的贵州省黎平县、剑河县以及榕江县等6个采样点，通过采集在相似气候条件下不同土壤中生长的黄花蒿植株及根际土壤，对野生黄花蒿叶片酚类物质（东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素）含量与土壤养分、酶活性以及微生物磷脂脂肪酸（PLFAs）含量进行测定，并对其进行相关性分析及因子分析，探索黄花蒿土壤特征对黄花蒿酚类物质累积的影响因素，为提高人工栽培黄花蒿的品质提供科学的理论依据。

1材料与方法

1.1试验区域选择

采样地点位于贵州省黔东南苗族侗族自治州剑河县、榕江县、黎平县，均属亚热带湿润季风气候，年平均气温15.6～18.1 ℃，无霜期310～326 d，降水量1 093.2～1 226.5 mm，采样地点气候条件基本一致。样地均为典型的丘陵山区地形地貌，黄花蒿自然生长均在3年以上，形成了优势植物，群落内以及周围含有杂草，没有木本植物。

1.2样品采集

采样时间为2015年8月，在花蕾期采集黄花蒿植株及根际土壤。每个样地随机采集长势基本一致的黄花蒿植株以及根际土壤，采集生长土壤时，挖取黄花蒿植株，抖掉易脱落的土壤，收集黏附于根系表面的土壤（每株约20 g）。取样后，将土样平均分成2份，装入无菌塑料样品袋，迅速运回实验室，剔除石块、植物残根等杂质，一份自然风干，检测土壤理化性质及酶活性，另一份于-4 ℃冰箱中保存，用于测定土壤微生物标记性的磷脂脂肪酸含量；收集新鲜黄花蒿叶片，测定东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素的含量，取少量叶片于60 ℃烘干测定水分系数。采集黄花蒿样点的地理信息及土壤类型如表1所示。

1.3测定项目与方法

采用常规方法检测土壤基本理化性质[16]，土壤pH值采用玻璃电极法（25 mL水、5 g土） 测定；有机质含量采用重铬酸[CM（25]钾氧化-外加热法测定；土壤全氮、全磷、全钾含量的测定[CM）][FL）]

色法、1 mol/L乙酸铵浸提-火焰光度法。土壤脲酶活性测定采用苯酚-次氯酸钠比色法[17]；蔗糖酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法[18]；磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法[19]。

黄花蒿叶片东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量采用高效液相色谱仪（HPLC-20AT）分析[20]，将黄花蒿新鲜叶片用研钵磨碎，精确称取0.500 0 g，加入20 mL无水乙醇，静置过夜，超声处理30 min，过滤，采用色谱柱Waters PAH C18 （250 mm × 4.6 mm × 5 μm）、二极管阵列检测器及Lc-solusion 2.5色谱工作站，流动相A相乙腈、甲醇体积比为 11 ∶[KG-*3]5，B相水、甲酸体积比为0.1 ∶[KG-*3]100，检测波长为345 nm，梯度洗脱，通过外标法计算其含量。

新鲜土壤微生物PLFAs含量采用气相色谱-质谱联用仪（GCMS-QP2010）分析。参照Bligh等的方法[21]对土壤微生物的PLFAs进行提取；色谱柱为HP-5MS（30 m×0.25 mm×0. 25 μm）石英毛细管色谱柱；升温程序为70 ℃（5 min），以20 ℃/min升至190 ℃（1 min），以5 ℃/min升至200 ℃（2 min），再以10 ℃/min 升至280 ℃（8 min）；进样口温度为250 ℃；离子源温度为230 ℃；载气为He（0.9 mL/min）；分流比为10 ∶[KG-*3]1，质量扫描范围30～500 m/z。内标为十九烷酸甲酯标准品，土壤微生物脂肪酸甲酯混和标样为细菌酸甲酯混合物（bacterial acid methyl esters mix，47080-U，Sigma-Aldrich）。

按照Frostegard等的方法[22]对PLFAs进行命名。细菌类群的PLFAs为2-OH 10：0、11：0、12：0、2-OH 12：0、3-OH 12：0、13：0、14：0、2-OH 14：0、15：0、i15：0、α15：0、16：0、2-OH 16：0、i16：0、i17：0、ω7c16：1、cy17：0、17：0、cy17：0。其中格兰氏阳性细菌（G+）为i15：0、α15：0、i16：0、i17：0；格兰氏阴性细菌（G-）为2-OH 10：0、2-OH 12：0、3-OH 12：0、2-OH 14：0、2-OH 16：0、16：1ω7c、cy17：0、cy19：0[21-22]。真菌類群为18：2ω6，9、18：1ω9c，18：1ω9t。放线菌类群为10Me18：0。线虫为20：0[23]。

1.4统计分析

每组试验均作空白处理和3组平行试验。数据通过 Excel 进行整理和绘图，采用SPSS 18.0统计软件进行方差分析、单因素方差分析检验样地间酚类物质、土壤特征是否存在显著性差异；多重比较采用LSD法；土壤特征与黄花蒿酚类组分之间的相关性采用Pearson相关分析；黄花蒿酚类组分的土壤影响因素采用因子分析。

2结果与分析

[HTK]2.1黄花蒿酚类物质含量分析[HT]

由图1可知，东莨菪内酯、猫眼草酚和猫眼草黄素含量分别为490.6～1 283.6、82.1～348.3、232.5～587.6 mg/kg，并且其含量表现为东莨菪内酯>猫眼草黄素>猫眼草酚；东莨菪内酯含量较高的样地为QH-T1、QH-T2、QH-T3，猫眼草酚含量较高的样地为QH-T1、QH-T3，猫眼草黄素含量较高的样地为QH-T1；QH-T3、QH-T4样地样品的东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量均差异显著；东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量最高分别是最低的2.61、4.24、2.53倍。说明黄花蒿东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量受气候条件及土壤环境等多因素的综合影响。

2.2黄花蒿土壤养分特征

由表2可知，不同黄花蒿样地土壤pH值存在差异，pH值在6.13～7.65之间。棕壤和黄棕壤的pH值高于黄壤。土壤全量养分是衡量土壤肥力的重要指标之一，且不同土壤类型的土壤全量养分不同。测定样品土壤中全氮含量最高的是最低的2.38倍，土壤全磷含量最高的是最低的6.19倍，而全钾含量最高的是最低的2.04倍。黄花蒿土壤全氮、全磷含量与东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量变化没有明显的规律性关系，说明土壤全氮、全磷对黄花蒿东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量的变化没有直接影响。不同样地样品的黄花蒿土壤碱解氮、有效磷、速效钾含量分别在16.95～75.61、5.54～47.59、42.04～613.78 mg/kg之间。图1显示QH-T4样品的黄花蒿东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量均较低，其土壤碱解氮、有效磷、速效钾含量也较低，说明黄花蒿土壤有效养分有助于植物根系吸收养分，提高植物内部营养元素的形成，这与相关文献报道的结果[14]基本一致。不同样地黄花蒿土壤有机质含量在7.00～ 29.70 g/kg之间，有机质含量较高的QH-T5、QH-T6样品，其碱解氮和有效磷含量也较高，而有机质含量最低的QH-T4样品，其碱解氮和有效磷含量也较低，说明土壤有机质不但是土壤肥力的重要指标，也是土壤中氮和磷的重要来源。

2.3黄花蒿土壤酶活性特征

土壤酶作为土壤生态系统最为活跃的生物活性物质，能够促进物质循环与能量流动，某种程度上反映了土壤养分的动态转化[24]。脲酶能催化尿素水解，土壤氮素状况及理化性状与其活性变化有关。由图2可知，不同样地土壤脲酶活性在11.94～27.25 mg/g之间（图2-A），有些样地间脲酶活性差异显著，QH-T5样品脲酶活性为27.25 mg/g，是QH-T4样品脲酶活性（11.94 mg/g）的2.28倍；脲酶活性与碱解氮含量变化类似，QH-T5的碱解氮含量与脲酶活性均较高，说明脲酶能够促进氮含量转换和利用。蔗糖酶反映了土壤生物活性强弱与物质转化的速度，由图2-B可知，不同样地黄花蒿土壤蔗糖酶活性存在差异，在136.50～831.65 mg/g之间，有些样地间蔗糖酶活性差异显著，QH-T6样品蔗糖酶活性为831.65 mg/g，是QH-T4样品蔗糖酶活性（136.50 mg/g）的6.09倍，说明土壤生物活性强度与物质转化的速度存在差异。磷酸酶能够促进有机磷化合物分解，其活性直接影响土壤中磷的有效性，由图2-C可知，不同样地间黄花蒿土壤磷酸酶活性存在差异，在6.18～43.15 mg/g之间，有些样地间磷酸酶活性差异显著，QH-T6样品的磷酸酶活性（43.15 mg/g）是QH-T4样品磷酸酶活性（6.18 mg/g）的 6.98 倍，说明不同样地间黄花蒿土壤中分解磷酸酶的能力存在差异。不同样地样品黄花蒿土壤脲酶、蔗糖酶以及磷酸酶活性的差异表明土壤类型影响土壤酶活性，从而影响其酚类物质的积累，主要体现在黄花蒿酚类物质含量的差异上。[FL）]

2.4黄花蒿土壤微生物特征

类群不同的土壤微生物，其活细胞的PLFAs组成成分具有相对的稳定性，通过其丰度及组成可对土壤微生物群落结构进行动态监测[25]。本试验不同样地黄花蒿土壤中共检出19种PLFAs，包括细菌14种、真菌（C18：2ω6，9、18：1ω9c，18：1ω9t）、放线菌（10Me18：0）、线虫（20：0）；不同样地黄花蒿土壤微生物包括G+、G-、细菌、真菌、放线菌、线虫。由表3可知，土壤微生物的PLFAs含量存在差异，G+、G-、细菌、真菌、放线菌、线虫以及总微生物PLFAs的含量范围分别为1.38～4.10、3.54～10.68、43.71～135.05、2.83～1080、477～787、0.48～0.84、54.87～147.62 mg/kg，有些样地间PLFAs含量差异显著，最高含量分别是最低含量的 2.97、301、309、3.81、1.65、1.75、2.69倍；黄花蒿土壤微生物的PLFAs含量均表现为细菌最高、线虫最低，并且细菌的PLFAs含量占总微生物PLFAs的77.30%～ 91.48%，表明细菌在活化黄花蒿土壤养分方面起主要作用。变异系数反映了采样点之间的平均变异程度，不同样地黄花蒿土壤各种微生物PLFAs含量的变异系数均大于10%，为中等变异强度，表明不同样地黄花蒿土壤微生物群落结构、丰度和组成成分存在差异。

2.5土壤特征與黄花蒿酚类组分含量的相关性分析

不同土壤类型，其理化性质也不同，黄花蒿酚类组分存在差异。由表4可知，东莨菪内酯含量与猫眼草酚、猫眼草黄素含量呈显著正相关（P<0.05），表明黄花蒿东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素的累积是相互促进的。有机质具有改善土壤理化性质的重要作用，黄花蒿土壤有机质含量与酚类物质含量均未呈显著相关，说明有机质并不直接影响黄花蒿酚类物质的累积，有机质含量与有效磷含量、碱解氮含量、全氮含量、全磷含量、磷酸酶活性、脲酶活性、蔗糖酶活性呈显著或极显著正相关（P<0.05或P<001），表明有机质可能是土壤氮和磷的来源。土壤pH值与微生物总PLFAs含量呈显著负相关（P<0.05），与磷酸酶活性、蔗糖酶活性呈极显著负相关（P<0.01），表明pH值的升高不利于微生物生长，同时减小酶的活性。土壤酶是土壤中具有生物活性的蛋白质，可与微生物共同推动土壤生物化学过程。磷酸酶可催化磷酸脂类或磷酸酐的水解，其活性直接影响土壤中磷的生物有效性，磷酸酶[CM（25]活性与土壤有效磷含量呈极显著正相关（P<0.01），磷酸酶能将土壤中有机磷或无机磷转化为植物可吸收利用的形态。黄花蒿土壤有效磷含量与东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量呈显著或极显著正相关（P<0.05或 P<0.01），说明土壤有效磷能够促进黄花蒿叶片东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量的增加，主要源于磷酸酶的活化；土壤速效钾含量与猫眼草黄素含量呈显著正相关（P<0.05），全钾含量与猫眼草酚、猫眼草黄素含量分别呈显著正相关（P<0.05）、极显著正相关（P<001），表明速效钾可以促进猫眼草黄素含量的增加；土壤微生物总PLFAs含量与全钾含量呈显著正相关（P<005），说明黄花蒿土壤微生物可以活化土壤中的钾，使得土壤中有效磷和速效钾的含量得到提高，有利于黄花蒿对有效磷和速效钾的吸收利用，从而促进黄花蒿植株的生长以及叶片中东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素的累积。

2.6土壤养分及微生物与黄花蒿酚类物质含量因子分析

对黄花蒿土壤有机质含量、全氮含量、全磷含量、全钾含量、碱解氮含量、有效磷含量、速效钾含量、脲酶活性、磷酸酶活性、蔗糖酶活性、微生物总PLFAs含量以及pH值影响黄花蒿东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量的12项指标进行因子分析，通过KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）、Bartlett检验，结果得到KMO值为0573，P值为0.000，小于显著水平005，表示适合做因子分析。由表5可知，前3个公共因子的特征值均大于1，累积方差贡献率达到88.221%，表明前3个公共因子基本可以反映影响整个黄花蒿东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量因子的信息。

由于各因子负载值趋于两极分化，对前3个公共因子采用方差极大正交旋转后的因子载荷矩阵具有一定的生物学意义。基于各因子在某一成分的载荷大小确定其所起作用，由表6可知，速效钾、有效磷含量和pH值3项指标对第1个公共因子起主要作用，方差贡献率为54.293%。有机质含量、碱解氮含量、全氮含量、脲酶活性、磷酸酶活性、蔗糖酶活性、微生物总PLFAs含量等7个指标对第2个公共因子起主要作用，其方差贡献率为 19.452%，全钾、全磷含量这2项指标对第3个公共因子起主要作用，其方差贡献率为14.068%。结果表明，影响黄花蒿东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量的主要因子有速效钾、有效磷含量，其次为有机质含量、碱解氮含量、全氮含量、磷酸酶活性、脲酶活性、蔗糖酶活性、微生物总PLFAs含量，这和分析土壤特征与黄花蒿酚类组分相关性的结果基本一致。

3结论

通过不同样地土壤特征与黄花蒿酚类物质含量的相关分析及因子分析，初步明确土壤有效磷含量能够促进黄花蒿叶片东莨菪内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素含量的增加，速效钾含量能够促进猫眼草黄素含量的增加；人工栽培黄花蒿可结合当地土壤实际状况，适量增施磷肥与钾肥，可促进黄花蒿东莨菪[CM（25]内酯、猫眼草酚、猫眼草黄素的累积。这为人工栽培

蒿，提高黄花蒿的品质提供了科学的理论依据。

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