红富士苹果果实炭疽病病菌的分离与鉴定

陈汝+王金政+薛晓敏+王贵平

摘要：采集具有炭疽病症状的红富士果实样品进行组织分离、培养，获得苹果炭疽病菌株（编号为Acg1），采用形态学、分子生物学相结合的方法对其进行鉴定。根据分离菌株的菌落、分生孢子形态特征、rDNA-ITS序列分析将分离到的Acg1菌株鉴定为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

关键词：苹果；炭疽病菌；分离；鉴定；胶孢炭疽菌

中图分类号： S436.611.1+2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）11-0079-02[HS）][HT9.SS]

我国是世界苹果生产第一大国[1]，红富士是从普通富士的芽变中选育出的着色系的统称，病害是制约苹果产业发展的重要因子。李保华等针对苹果病害管理中存在的问题进行分析并对苹果病害方面的研究进展进行综述[2]。炭疽菌属（Colletotrichum）是一类重要的植物病原真菌，可引起果实和叶子发生炭疽病害，并广泛分布于热带、亚热带地区[3]。近年来，炭疽菌属分类研究一直是国内外研究热点，并且分子生物学技术广泛应用于炭疽菌的分类研究[4-7]。研究表明，胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是苹果生长期和贮藏期的主要侵染性病害，是造成产量和品质损失的主要原因之一[8-10]。本研究从疑似炭疽病的红富士发病果实上采用组织分离法获得炭疽病源菌株，并采用rDNA-ITS序列分析和形态学相结合的方法对其进行鉴定，为苹果炭疽病害的生物防控提供依据并奠定基础。

1材料与方法

1.1样品采集

具有炭疽病症状的红富士果实样品采自山东省果树研究所天平湖基地红富士苹果园。

1.2病原菌的分离及形态特征观察

采用组织分离法。先用70%乙醇表面消毒具有炭疽病症状的红富士苹果样品，再用灭菌的解剖刀在病健交界处切下3 mm×5 mm的组织块，用70%乙醇消毒1 min，再用01%氯化汞处理40 s，最后用无菌水冲洗干净后置于PDA培养基上，25 ℃下暗培养3 d，挑取单个菌落菌丝，转移到新的PDA平板培养基上，25 ℃下暗培养6 d，保存得到的纯菌株，观察并记录菌落形态学特征，挑取分生孢子进行显微形态观测并记录孢子的形状大小。

1.3DNA提取和PCR扩增

真菌总DNA提取采用OMEGA公司试剂盒，提取的DNA溶解后于-20 ℃贮存备用。以菌丝总DNA为模板，对ITS区进行扩增，以ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）[11]、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[12]为引物（由上海铂尚生物技术有限公司合成）。

25 μL PCR反应体系：2.5 μL 10×PCR buffer（2.50 mmol/L，含Mg2+）、2.00 μL dNTPs（2.50 mmol/L）、050 μL ITS1（10.00 μmol/L）、0.50 μL ITS4（10.0 μmol/L）、0.75 μL DNA模板、0.25 μL（5.00 U/μL）Taq酶、18.50 μL灭菌水。

PCR扩增反应在BIO-RAD S1000TM PCR扩增仪上进行。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR产物由1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物回收纯化后与pMD 18-T载体连接，转化感受态细胞（大肠杆菌DH5α），挑取阳性克隆送上海铂尚生物技术有限公司进行测序。

1.4序列分析及构建系统进化树

所得序列在国际核酸数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中进行同源序列搜索。将分离菌株序列用Clustal X软件[13]进行多个序列比对，并与GenBank中的相关序列进行同源性比较，然后用MEGA 4.1软件中邻位加入（neighbor-joining，简称NJ）构建系统发育树。

2结果与分析

2.1病原菌形态特征

经组织分离，获得病原物的纯培养物（编号为Acg1），PDA培养基上25 ℃培养，菌落呈圆形生长，边缘规则，气生菌丝较发达，初期为白色，培养4～6 d后逐渐变为浅灰色至灰黑色（图1-A）。菌落在25 ℃时的生长速率是（11.90±0.61）mm/d。后期产生橘红色分生孢子团，分生孢子长椭圆形，分生孢子表面光滑，无色，单胞，圆柱形或椭圆形，多数两端钝圆，大小为（17～22.6×4.0～6.0）μm（n=50）（图1-B）。以上结果显示，菌株形态特征与符丹丹等描述的苹果炭疽菌的形态[14]基本一致。因此，红富士苹果的炭疽病原菌可以初步确定为炭疽菌属。

2.2序列分析和构建系统进化树

以纯培养物总DNA为模板，ITS1、ITS4为引物，经PCR扩增，获得大小为584 bp的rDNA-ITS基因片段。Blast搜索结果显示，该片段与炭疽菌的同源性高达99%以上。采用Clustal X软件多序列比对后用MEGA 4.1软件构建系统进化树，结果显示，从染病红富士果实分离的炭疽病菌株与C. gloeosporioides（GenBank编号为EU552111）、C. gloeosporioides（GenBank编号为AJ301908）、C. gloeosporioides（GenBank编号为GU174543）、C. gloeosporioides（GenBank编号为KC122769）聚在同一分支上（图2）。据此，将该炭疽病原菌3结论与讨论

炭疽病是危害苹果生产的重要病害，严重影响苹果的产量及品质。炭疽菌种类多、变异大，种间形态学特征近似，仅基于形态学的炭疽菌鉴定是不够准确的。随着分子生物学的发展，分子技术广泛用于植物病原菌的分类与鉴定。近年来，rDNA核酸序列逐渐应用于真菌分类鉴定系统中，相对保守的18S、28S区域用于属、种的分类鉴定，而变异性较大的ITS区域能反映出种间以及种内不同个体间的差异。国内学者依据病原菌形态特征及DNA序列分析的方法對苹果[14]、蓝莓[6]、茶树[7]、甜柿[15]炭疽病菌进行鉴定，表明炭疽病菌在果树上存在多样性。

苹果炭疽病菌主要包括胶孢刺盘孢[Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz.&Sacc.]和尖孢刺盘孢[Colletotrichum acutatum J. H. Simmonds]两大复合类群中的物种[14]。本研究根据传统的真菌形态学鉴定及病原菌rDNA-ITS序列的同源性与系统聚类分析结果，确定采集的具有炭疽病症状的红富士果实样品中分离得到的病原菌是胶孢刺盘孢。今后将对更多苹果园中感病样品进行分析，炭疽菌的准确鉴定能为炭疽病的防治提供理论依据。

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