MAE-LC-AFS测定鸡蛋中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸

姜涛，崔颖，倪松

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300461；2.天津出入境检验检疫局，天津300461）

MAE-LC-AFS测定鸡蛋中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸

姜涛1，2，崔颖2，倪松2

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300461；2.天津出入境检验检疫局，天津300461）

建立微波辅助萃取-液相色谱-原子荧光光谱法（Microwave Assisted Extraction-Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry，MAE-LC-AFS）测定鸡蛋中阿散酸（Arsanilic，ASA）、洛克沙砷（Roxarsone，ROX）、硝苯砷酸（Nitarsone，NIT）的分析方法。研究并优化液相色谱和原子荧光的工作条件。在0～2.0 mg/L范围内阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的线性关系良好，线性相关系数大于0.999，阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷检出限（S/N=10）分别为0.1、0.2、0.2 mg/kg。阿散酸在0.1、0.2、0.5 mg/kg 3个加标水平下的平均回收率为80.5%～91.0%，相对标准偏差为3.14%～3.77%；硝苯砷酸和洛克沙砷在0.2、0.5、2 mg/kg，3个加标水平下平均回收率为81.0%～91.1%和82.5%～104.9%，相对标准偏差为2.72%～4.02%和1.81%～7.52%。

微波辅助萃取；液相色谱-原子荧光；鸡蛋；阿散酸；硝苯砷酸；洛克沙砷

砷是一种有毒的非金属元素，按其存在形式分为无机砷和有机砷，其中部分有机砷毒性较小而作为一种饲料添加剂广泛应用于养殖业，如阿散酸（Arsanilic，ASA）、洛克沙砷（Roxarsone，ROX）、硝苯砷酸（Nitarsone，NIT）。有机砷在畜禽产品中存在蓄积作用，过量的砷会导致畜禽多重器官组织功能紊乱和器质性病变，其蓄积作用也会通过生物链间接对人类健康造成影响[1-3]，所以砷含量是国家卫生标准的一项重要指标。目前对有机砷的研究主要集中在饲料[4-6]和肉类食品[7]中，对蛋类中有机砷含量的研究较少，蛋类在人类食物结构中占有极其重要的位置，所以测定蛋类中的有机砷含量对于提高百姓餐桌上的安全性以及保障人民群众的身体健康有着重要意义。

食品中有机砷的测定方法有原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法（Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS）、原子吸收光谱法、比色法等，其中原子荧光光谱法是近几年发展起来的一种新型痕量元素分析技术[8]，具有简便快速、灵敏度高[9]、共存元素干扰少[10]、适用于多元素同时分析[11]等优点，广泛应用于食品中砷元素的检测。样品测定前需要预先消化，微波消解作为一种新型的消解方式，具有空白值低、消解速度快、待测元素损失率低和样品被污染的可能性低等优点，同时降低了劳动强度及分析成本，并改善了工作环境。目前在各种样品的消解处理中已得到广泛应用[12-14]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-AFS9800液相色谱-原子荧光联用仪：北京海光仪器公司，由液相色谱仪（包括液相色谱泵和进样装置）与原子荧光光谱仪组成；Explorer48微波辅助萃取仪：美国CEM公司；T18均质器：德国IKA公司；LD4-2型离心机：北京医用离心机厂；超纯水仪、0.45 μm滤膜：美国Millipore公司；反相C18色谱柱：（1）250 mm×4.60mm，5μm，DIKMA公司，型号Cat.no：99603；（2）250 mm×4.60 mm，5 μm，Waters公司，型号WAT054275；（3）250 mm×4.60 mm，5 μm，phenomenex公司，型号00G-425-E0。

阿散酸（p-Arsanilic acid，CAS编号：2045-00-3，C6H8AsNO3）标准品（纯度大于等于99%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德国）；洛克沙砷（3-Nitro-4-hydroxy-phenylarsonic acid，CAS编号：121-19-7，C6H6AsNO6）标准品（纯度大于等于97.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德国）；硝苯砷酸（4-Nitrophenylarsonic acid，CAS编号：98-72-6，C6H6AsNO5）标准品（纯度大于等于95%，日本和光纯药工业株式会社）；甲醇为色谱纯；盐酸为优级纯；三氟乙酸、氢氧化钠、硼氢化钾、磷酸二氢钾均为分析纯；试验用水为超纯水，鸡蛋为市售。

阿散酸标准储备溶液：准确称取适量的阿散酸标准品，用去离子水配成浓度为500 μg/mL的标准储备液。根据需要用去离子水稀释成适当浓度的标准工作液。

洛克沙砷标准储备溶液：准确称取适量的洛克沙砷标准品，用去离子水配成浓度为500 μg/mL的标准储备液。根据需要用去离子水稀释成适当浓度的标准工作液。

硝苯砷酸标准储备溶液：准确称取适量的硝苯砷酸标准品，用去离子水配成浓度为500 μg/mL的标准储备液。根据需要用去离子水稀释成适当浓度的标准工作液。

1.2 液相色谱-原子荧光联用分析条件

液相色谱条件为色谱柱：反向C18色谱柱（柱长250 mm，粒径4.6 mm），或相当者；流动相为甲醇-磷酸二氢钾溶液（5+95，体积比）；流速：1.2 mL/min；进样量100 μL。

原子荧光工作条件为灯电流：100 mA；负高压：320 V；载气流速：400 mL/min；屏蔽气流：950 mL/min。

1.3 样品前处理

取一颗鸡蛋，去壳，把蛋清蛋黄搅匀，放于均质器均质5 min，备用。

2 结果与讨论

2.1 微波萃取条件的选择

称取试样1 g（精确至0.001 g）于微波辅助萃取内罐中，加入10 mL甲醇溶液，按照微波辅助萃取仪的标准操作步骤进行提取。提取完毕，取出冷却至室温，10 000 r/min离心10 min。取4 mL上清液，氮气吹扫，用甲醇溶液定容至2 mL，经0.45 μm有机滤膜过滤后进行测定。按同一操作方法作空白试验。

2.1.1 萃取剂浓度的选择

分别用浓度为10%、20%、30%、40%、50%的甲醇溶液，测试加0.2 mg/kg阿散酸、洛克沙砷和硝苯砷酸的混合标液的鸡蛋样品的加标回收率。微波萃取仪萃取时间为40 min，萃取温度为50℃。不同浓度的甲醇溶液提取效率如图1。

图1 甲醇溶液浓度对萃取率的影响Fig.1 Effect of methanol concentration on extraction rate

由图1可知，随着甲醇溶液浓度的增加，提取效果逐渐提高，但是当甲醇溶液提高到一定程度时，提取效率反而下降。因此最终选择甲醇溶液体积分数为30%。

2.1.2 萃取时间的选择

萃取时间是影响萃取效果的重要因素。试验分别选择20、40、60、80、100 min的萃取时间，微波萃取仪萃取浓度为30%，萃取温度为50℃，有机砷混合标液萃取效果如图2。由图2可知，随着萃取时间的增加，萃取效果越高，萃取时间超过60 min后，萃取效果提高不明显。为提高工作效率，最终选择萃取时间为60 min。

图2 萃取时间对萃取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate

2.1.3 萃取温度的选择

微波萃取仪的使用温度范围为-80℃～300℃。试验分别设定45、55、65、75、85℃的萃取温度，甲醇溶液浓度为30%，提取时间为60 min，不同萃取温度效果如图3。由图3可知，最佳萃取温度为65℃。

图3 萃取温度对萃取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate

经过对影响萃取效果的3个因素的试验，最终选择萃取剂浓度为30%甲醇溶液，萃取时间为60 min，萃取温度为65℃。

2.2 液相色谱条件的选择

2.2.1 流动相的选择

图4 不同浓度流动相对应砷形态的相对峰面积Fig.4 Relative peak area of arsenic species in different mobile phases

2.2.2 色谱柱的选择

试验使用了3种反相C18色谱柱进行测试，规格为250 mm×4.60 mm，5 μm。试验结果表明（1）组分分离情况不好；（2）柱效好，分离时间短；（3）分离效果好，价格便宜，能满足实际需要。从实用性和性价比考虑，最终选择（3）作为试验色谱柱。

2.3 原子荧光工作条件的选择

2.3.1 光电倍增管负高压和灯电流的选择

增大光电倍增管负高压可提高荧光强度，但噪声也相应增大，当负高压增大到一定程度时，信噪比反而开始下降。试验考察了负高压为300、310、320、330、340 V时的各砷形态信噪比，如表1。结果表明当负高压为320 V时，各砷形态信噪比最高。

表1 负高压对砷形态信噪比的影响Table 1 Effect of negative high voltage on signal-to-noise ratio of arsenic species

2.3.2 灯电流的选择

增大空心阴极灯的灯电流，荧光强度也随着增强，但是当灯电流过大时会发生自吸现象，此时荧光强度反而减弱，并且过大的灯电流会缩短灯的使用寿命。试验考察灯电流为80、90、100、110、120 mA时的荧光强度，结果表明当灯电流为100 mA时，荧光强度最高。

我国对于企业财务风险管理的研究起步较晚，最早开始于19世纪八十年代左右。最早开始研究财务风险的学者是刘恩禄，初版的刊物《论财务风险管理》首次阐明财务风险存在的特性和管理上的重难点，以及管控财务风险对于企业经营的重要意义。之后，许多学者开始重视企业的财务风险管理，先后出版了许多关于财务管理的论著。1998年开始，随着中国保险行业的兴起，学者的注意力开始转向保险企业，主流观点包括：我国保险行业处于逐步成长过程中，相关的风险管理体制还尚未完全同步；中国保险企存在偿付能力不足的问题，并且保险行业缺乏一定的市场竞争力，等等。

2.3.3 载气流速的选择

载气在氢化反应过程中起着将氢化物带入到原子化器中和提供氩氢火焰燃烧需要的氩气的作用。当载气流量较小时，形成的氩氢火焰不够稳定，导致测量的重现性不好。当载气流量增大到一定程度时又会冲淡稀释氢化物，导致荧光强度降低，过大的载气流量甚至会冲断氩氢火焰，导致测量不到荧光信号。试验考察了载气流速为200 mL/min～600 mL/min时对荧光强度的影响，结果见图5，可知，当载气流速为400 mL/min的时候，荧光强度最高。因此，试验选择400 mL/min的载气流速。

图5 载气流量对砷形态荧光信号强度的影响Fig.5 Effect of carrier gas flow on fluorescence signal intensity of arsenic species

2.3.4 屏蔽气流速的选择

屏蔽气作为氩氢火焰的外围保护气体，能够防止周围空气将原子蒸汽氧化，从而使氩氢火焰保持稳定状态。试验考察屏蔽气流速为750、850、950、1 050、1 150 mL/min时对荧光强度的影响，结果见图6。

图6 屏蔽气流量对砷形态荧光信号强度的影响Fig.6 Effect of shield gas flow rate on fluorescence signal intensity of arsenic species

由图6表明，当屏蔽气流量达到950 mL/min时，荧光强度最高。因此，试验选择屏蔽气的最佳流速为950 mL/min。

2.3.5 硼氢化钾质量浓度的选择

当硼氢化钾浓度较低时，氢化反应不完全，而当硼氢化钾浓度过高时产生了过多的氢气，导致样品的氢化物浓度被稀释，灵敏度下降。试验考察了硼氢化钾质量浓度在5.0 g/L～30.0 g/L范围内对0.2 mg/kg混合标准溶液荧光强度的影响，结果见图7。从图7可以看出，当达到20.0 g/L时，荧光强度最大。之后随着硼氢化钾浓度再升高，荧光强度开始降低。试验选择硼氢化钾溶液的浓度为20.0 g/L。

图7 硼氢化钾浓度对砷形态氢化物发生的影响Fig.7 Effect of KBH4concentration on arsenic hydride formation

2.4 检出限、线性范围及线性关系

在优化条件下，以峰面积对浓度作图，得到阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷的线性范围、相关系数、线性方程及检出限见表2。

表2 阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙砷的线性范围、线性方程和相关系数Table 2 The linear range，linear equation and correlation coefficient of ASA，ROX and NIT

在所测定的浓度范围内，3种有机砷形态化合物的线性相关系数均大于0.999。

2.5 加标回收率

在鸡蛋样品添加不同浓度的阿散酸、硝苯砷酸和洛克沙砷，通过MAE-LC-AFS的分析结果见表3。由表3可知，阿散酸的加标回收率在80.5%～91.0%之间，硝苯砷酸的加标回收率在81.0%～91.1%之间，洛克沙砷的加标回收率在82.5%～104.9%之间，阿散酸的相对标准偏差小于7.52%。

3 结论

采用微波辅助萃取（Microwave Assisted Extraction，MAE）的前处理方法，液相色谱-原子荧光（Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry，LCAFS）联用技术测定鸡蛋中阿散酸、洛克沙砷和硝苯砷酸3种有机砷形态，阿散酸在0.1、0.2、0.5 mg/kg 3个加标水平下的平均回收率为80.5%～91.0%，相对标准偏差为3.14%～3.77%；硝苯砷酸和洛克沙砷在0.2、0.5、2mg/kg，3个加标水平下平均回收率为81.0%～91.1%和82.5%～104.9%，相对标准偏差为2.72%～4.02%和1.81%～7.52%。本方法操作简单快速、检出限低、重现性好，是一种适用于鸡蛋中砷形态检测的有效方法。

表3 阿散酸、洛克沙砷和硝苯砷酸回收率和相对标准偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviation of ASA，ROX and NIT

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Determination of Arsanilic，Nitarsone and Roxarsone in Eggs by MAE-LC-AFS

JIANG Tao1，2，CUI Ying2，NI Song2
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300461，China；2.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

A method for determination of arsanilic（ASA），nitarsone（NIT）and roxarsone（ROX）residues in eggs was developed by Microwave Assisted Extraction-Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry（MAE-LC-AFS）.The working conditions of liquid chromatography and atomic fluorescence were studied and optimized.The linearity of arsanilic，nitarsone and roxarsone in the range of 0-2.0 mg/L was good，linear correlation coefficient was greater than 0.999.The detection limits of ASA，NIT and ROX were 0.1，0.2，0.2 mg/kg，respectively.The average recoveries of arsanilic were 80.5%-91.0%at the levels of 0.1，0.2，0.5 mg/kg，RSDs were 3.14%-3.77%.The average recoveries of nitarsone and roxarsone were 81.0%-91.1%and 82.5%-104.9%at the levels of 0.2，0.5，2.0 mg/kg，RSDs were 2.72%-4.02%and 1.81%-7.52%.

Microwave Assisted Extraction（MAE）；Liquid Chromatography-atomic Fluorescence Spectrometry（LCAFS）；eggs；arsanilic（ASA）；nitarsone（NIT）；roxarsone（ROX）

2016-11-18

姜涛（1987—），男（汉），助理农艺师，本科，主要从事食品检测。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.035