金黄色葡萄球菌定量检测能力验证结果与分析

陆其聪，钟宇思，王立博，成晓情

（1.国家轻工业食品质量监督检测成都站，四川成都610081；2.四川省轻工业研究设计院，四川成都610081）

金黄色葡萄球菌定量检测能力验证结果与分析

陆其聪1，2，钟宇思1，2，王立博2，成晓情1，2

（1.国家轻工业食品质量监督检测成都站，四川成都610081；2.四川省轻工业研究设计院，四川成都610081）

采用Baird-Parker（BP）平板计数法、显色培养法分别对金黄色葡萄球菌能力验证的两个样品进行定量检测，考核样品16-K717、16-Y374的菌落数分别为173 000、86 CFU/mL。试验结果由中国检验检疫科学研究院检测中心给予评价，Z值分别为0.68、0.38，都取得了满意结果。结果表明显色培养法比Baird-Parker更适合于金黄色葡萄球菌的定量检测。

金黄色葡萄球菌；定量检测；能力验证

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为革兰氏阳性球菌，呈葡萄球状排列，无芽孢，无荚膜。它属于嗜温性微生物，能在7℃～48℃范围内生长，在水分活度（0.86）和pH值（4.8）相对较低，高盐和糖浓度达15 %及含有二氧化氮的环境中仍能生长。由于金黄色葡萄球菌能在较恶劣的环境中生长，使得它们能在其他微生物不能生长的许多食物中成为优势种[1-3]。金黄色葡萄球菌能产生致病的肠毒素，健康成年人进食约30 g或30 mL含106～107个细胞数所产生100 ng～200 ng毒素的食物即可中毒，其特征是发病突然，来势猛烈，通常在进食1 h～4 h出现临床症状，特点是恶心，呕吐，头晕头痛，腹痛腹泻，重者可引起虚脱和休克。金黄色葡萄球菌毒素引起的食物中毒被认为是全球最常发生的食源性疾病[4]。近年来出现的“超级细菌”耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Stphylococcus aureus，MRSA）被发现存在于禽类体内，且感染率极高，由金黄色葡萄球菌引起的感染变得日益严重，并成为难治感染之一[5-7]，因而，准确地对食品中金黄色葡萄球菌的定量检测就显得尤为重要。

为了提高检测能力和水平参与了中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织和负责实施的食品微生物学指示菌能力验证[ACAS-PT187（2016）]。

1 材料与方法

1.1 菌株及样品

金黄色葡萄球菌[编号FSCC223004（ATCC6538）]、表皮葡萄球菌[编号FSCC 223011（CMCC（B）26069）]：广东环凯微生物科技有限公司；2瓶检验样品冻干粉末（编号分别为16-K717、16-Y374)：中国检验检疫科学研究院测试评价中心。

1.2 试剂与仪器

BP琼脂基础、脑心浸出液肉汤（BHI）、冻干血浆、卵黄亚碲酸钾增菌剂：广东环凯微生物科技有限公司；血琼脂平板：郑州安图生物工程股份有限公司；科玛嘉金黄色葡萄球菌显色培养基：郑州人福博赛生物技术有限公司。

YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DHG-9070A电热恒温干燥箱、AISET YLD-6000隔水式恒温培养箱：广东环凯微生物科技有限公司；BSC-1000ⅡA2生物安全柜：苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金黄色葡萄球菌的定量检测

BP平板计数法：样品达到后立即于2℃～8℃冰箱保存，试验前从冰箱中取出，使其达到室温后开启。瓶内加入4 mL无菌生理盐水，待溶解后，吸出放入无菌瓶内，用36 mL无菌生理盐水多次清洗样品瓶，将样品完全溶解在40 mL无菌生理盐水中。以无菌吸管吸取25 mL样品于225 mL灭菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成体积比1∶10的样品匀液。用1 mL无菌吸管吸取体积比1∶10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL无菌生理盐水试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），换用1支1 mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成体积比1∶100的样品匀液。依此类推，制成原液、10-1、10-2、10-3、10-4样品液。依据GB 4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》第二法进行检验。

由于GB 4789.10-2010第二法存在涂布不均匀，耗时的情况，同时以接种量每皿为0.2 mL进行检测，每个稀释管做5个平行平板[8-9]，其它步骤与GB 4789.10-2010第二法相同。

显色培养法：将41.3 g干粉缓慢倒入500 mL无菌水中，充分搅拌溶解，并加热至100℃，直至琼脂完全溶解。将培养基水浴冷却至48℃，分别取1 mL上述浓度的样品匀液于无菌培养皿中，每个浓度做2个平行，然后倾注（15±1）mL显色培养基，混匀使其凝固、倒置，37℃培养24 h。

1.3.2 菌落计数及鉴定

BP平板上典型菌落的计数和确认按GB 4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》第二法进行。

显色培养基上对紫红色、红色、粉红色菌落进行计数。并将部分可疑菌落划线于血平板，进行染色镜检和血浆凝固酶试验。

2 结果

2.1 BP平板计数法

样品16-K717在BP平板上菌落呈黑色，部分呈灰色，菌落周围有浑浊带，在其外层有透明圈的典型菌落。经鉴定，样品16-K717中金黄色葡萄球菌为173 000 CFU/mL，结果见表1。

样品16-Y374在BP上生长了大量杂菌，分别对不同形态的菌落进行计数和确认。通过对典型菌落的鉴定，表明典型菌落都是金黄色葡萄球菌，结果为86 CFU/mL，其它杂菌为干扰菌。

表1 样品在BP平板上检测结果Table 1 The results of samples on Baird-Parker plate

2.2 显色培养基平板计数法

显色平板上菌落大都为紫红色、红色和粉红色，存在极少量的蓝色菌落，对紫红色、红色和粉红色进行计数，结果见表2。金黄色葡萄球菌显色培养基上的可疑菌落通过血平板和血浆凝固酶试验证实都为金黄色葡萄球菌。

2.3 两种接种量在BP平板上检测结果

两种接种量在BP平板上检测结果见表3。

表2 样品在显色培养基上检测结果Table 2 The results of samples on chromogenic medium plate

表3 两种接种量在BP平板上检测结果Table 3 The results of samples on Baird-Parker plate by two methods

如表3所示，接种量0.2 mL的方法，样品16-K717、16-Y374结果分别为182 000、99 CFU/mL，检测结果比接种量0.3、0.3、0.4 mL的方法检测结果偏高。2.4 检测结果统计

表1、表2结果表明两个样品采用BP平板法与金黄色葡萄球菌显色培养法的结果差异不明显。从表3可以看出，接种量0.2 mL的方法，其检测结果要高于接种量0.3、0.3、0.4 mL的方法。考虑到能力验证选择的方法为GB4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》第二法，因此上报结果为16-K717：173 000 CFU/mL；16-Y374：86 CFU/ mL。统计评价结果见表4。

表4 金黄色葡萄球菌定量检测（BP平板法）统计评价结果Table 4 The quantitative test results of Staphylococcus aureus on Baird-Parker plate

反馈结果如表4所示，都取得了满意结果。本次能力验证共有80个实验室参与，其中结果可疑的有7个，不满意结果15个，共计60个实验室获得满意结果，满意率75%。

3 讨论

传统的BP法耗时长，选择性不强，且受涂布时间、涂布均匀度等人员熟练程度因素影响，菌落有时分布不均匀而难以计数，从而影响试验结果。这有可能是造成赵薇等用BP法与显色培养法检测结果差别大的原因[10]。在本文中，对BP平板涂布前做了一定的预处理，节约了涂布时间的同时使涂布更均匀，最终检测结果与显色培养法差异不大。

采用食品安全国家标准致病菌金黄色葡萄球菌的定量检测BP法，将接种量0.3、0.3、0.4 mL的方法与接种量0.2 mL的方法进行比较，发现接种量为0.2 mL的结果偏高，这与王洪亮[8]等研究结果一致。当接种量较大时，涂布耗时，不容易均匀。而接种量小时，涂布更均匀，避免了菌落重叠现象出现，检测结果更理想。因此，涂布的均匀性对检测结果影响较大。这与我们对BP平板涂布前作预处理后得出的结论一致。

食品中金黄色葡萄球菌的检测方法较多：BP法，显色培养法，以分子生物学为基础的快速检测方法，以计算机为基础的计算机视觉技术等[11]，我国食品中金黄色葡萄球菌定量检测的检测方法是传统的BP法，其它方法尚未大规模推广。从表2和表4中发现金黄色葡萄球菌显色培养法Z值更接近中位值，由此认为显色培养法在金黄色葡萄球菌的定量检测中更具优势。显色培养基选择性强，培养时间短，操作简单，能对金黄色葡萄球菌进行有效区分，节约了检测时间。所以显色培养法用于定量检测金黄色葡萄球菌更具有优势。这与许多学者研究结果一致[12-14]。在实际检测过程中采取何种方法应根据实验室实际情况及检测样品的情况而定。

实验室能力验证是利用实验室间比对来确定实验室检测能力的活动，是为确保实验室维持较高检测水平而对其能力进行的考核、监督和确认的一种验证活动[15]。可客观的反应实验室的检测水平；通过能力验证，实验室可以发现自身与其它实验室检测水平的差异，帮助实验室发现问题并寻求解决问题的办法；同时也是判定申请认可实验室的能力和获准认可实验室维持其技术能力的重要依据之一[16]。在本次能力验证中，两个样品都获得满意结果，且测定结果都与中位值比较接近。结合表2、表4，我们发现显色培养法也能得到可靠的结果，且显色培养法对金黄色葡萄球菌进行定量检测，检测时间短，选择性强，因而在金黄色葡萄球菌的定量检测中更具优势。

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Proficiency Testing Results and Analysis of Quantitative Detection of Staphylococcus aureus

LU Qi-cong1，2，ZHONG Yu-si1，2，WANG Li-bo2，CHENG Xiao-qing1，2
（1.Chengdu Test Center，State Light Industry Food Quality Supervision and Detection Station，Chengdu 610081，Sichuan，China；2.Light Industry Research and Design Institute of Sichuan Province，Chengdu 610081，Sichuan，China）

According to the Baird-Parker plate count method and chromogenic medium，the proficiency testing was conducted for quantitative detection of Staphylococcus aureus.The results of quantitative detection of Staphylococcus aureus in sample 16-K717 was 173 000 CFU/mL and in sample 16-Y374 was 86 CFU/mL.The evaluation of two samples test results were given by the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Comprehensive Inspection Center.Both of them were satisfactory as the Z score were 0.68，0.38 respectively.Compared with Baird-Parker plate count，chromogenic medium is more suitable for quantitative detection of Staphylococcus aureus.In general，this research provided certain support for the quantitative detection of Staphylococcus aureus.

Staphylococcus aureus；quantitative detection；proficiency testing

2016-12-09

陆其聪（1987—），女（汉），助理工程师，硕士，主要从事食品微生物检测工作。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.034