LC-MS/MS 法测定猪肉中泰妙菌素及8-α-羟基泰妙菌素

范宏

（承德护理职业学院，河北承德067000）

LC-MS/MS 法测定猪肉中泰妙菌素及8-α-羟基泰妙菌素

范宏

（承德护理职业学院，河北承德067000）

采用磷酸缓冲液-乙酸乙酯混合提取、正己烷除脂、MCX柱净化，采用液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）建立了同时测定猪肉中泰妙菌素及8-α-羟基泰妙菌素残留量的分析方法。结果表明：在泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素加标浓度5.0 μg/kg～500.0 μg/kg范围内，相关系数分别为0.999 8和0.999 7，线性关系良好；检测限（LOD）分别为1.5 μg/kg和3.0 μg/kg，定量限（LOQ）分别为5.0 μg/kg和10.0 μg/kg；平均回收率为83.4%～97.6%，相对标准偏差（RSD）为2.4%～5.3%。

泰妙菌素；8-α-羟基泰妙菌素；液相色谱-质谱法；猪肉

泰妙菌素（pleuromulin），又称泰妙霉素、泰妙灵，分子式为C28H47NO4S，CAS号为55297-95-5，是一种双萜烯类畜禽专用抗生素[1-2]，其抗菌谱与大环内酯类抗生素相近，用于畜禽呼吸道疾病及支原体关节炎等疾病的防治，目前是被全球广泛应用的主要兽用抗生素[2-4]。低剂量的泰妙霉素可提高饲料利用率，促进动物生长，但过量使用可导致泰妙霉素在体内残留或蓄积，并可通过食物链进入人体，危害人类健康。美国、欧盟、日本都明确规定了泰妙菌素最高残留限量（MRL），我国农业部235号规定了泰妙菌素及其代谢产物8-α-羟基泰妙菌素的总量，在猪体内组织最高残留限量：肌肉100 μg/kg，肝脏500 μg/kg[5]。但目前缺乏关于8-α-羟基泰妙菌素的检测方法标准。

当前关于泰妙菌素的检测方法主要有微生物法[3]、气相色谱法（GC）[2]、液相色谱法（HPLC）[6-7]、液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）[8-11]，其中微生物法前处理繁琐，准确度差；GC需要衍生化，操作复杂，精密度差；HPLC尽管仪器普及面广、定量准确，但是检出限高，无法用于低浓度兽药残留检测；LC-MS/MS具有检出限低，选择性高、灵敏度强等特点而广泛应用。本文采用磷酸缓冲液-乙酸乙酯混合提取、正己烷除脂、MCX柱净化，采用液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）同时测定猪肉中泰妙菌素及8-α-羟基泰妙菌素残留量，该方法检出限低，精密度好，准确度高，可用于进出口猪肉中泰妙菌素及其代谢产物8-α-羟基泰妙菌素残留量检验检测的要求，并为畜禽食品中泰妙菌素残留量检测方法标准的制修订提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂材料

Waters Acquity UPLC XEVO TQ MS型超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪：沃特世科技（上海）有限公司；Maxi Mix II型漩涡震荡器：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；XT-NS 1型全自动氮吹浓缩仪：上海新拓分析仪器科技有限公司；Milli-Q REFERENCE型超纯水系统：密理博中国有限公司；R-300型旋转蒸发仪：瑞士步琦有限公司；BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司。

泰妙菌素标准物质（纯度≥99%)：瑞士CARBOGEN AMCIS AG公司；8-α-羟基泰妙菌素标准物质（纯度≥99%）：山德士（中国）制药有限公司；甲醇、丙酮、正己烷、甲酸（均为色谱纯)：默克投资（中国）有限公司；浓盐酸、二氯甲烷、氢氧化钠（均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 溶液配制

分别称取泰妙菌素、8-α-羟基泰妙菌素各100.0mg（精确至0.1 mg），用适量甲醇溶解后，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻线，配制成各目标物浓度为2.0 mg/mL标准储备溶液，-20℃避光保存。分别吸取适量泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素标准储备溶液，先用甲醇配制成各目标物浓度为100 μg/mL的混合标准溶液，然后用20%甲醇溶液逐级稀释配制浓度为5、10、50、100、200 ng/mL的系列混合标准工作液，4℃避光保存。

磷酸缓冲液（pH=8.0)：称取0.52 g KH2PO4，16.73 g K2HPO4，以三蒸水定容至500 mL。磷酸缓冲液（pH= 4.5)：在磷酸缓冲液（pH=8.0）中滴加磷酸使其pH值为4.5。

1.3 LC-MS/MS

色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100mm，1.7μm）；柱温为35℃；流动相A为纯甲醇；流动相B为0.1%甲酸水溶液；流速：0.2 mL/min，进样量为10 μL。梯度洗脱程序为0.0 min～0.1 min，20% A；0.1 min～3.5 min，90%A；3.5 min～4.5 min，20%A；4.5 min～5.0 min，20%A。

质谱条件：电离方式为电喷雾电离，正离子模式ESI（+）；检测方式：多重反应监测（MRM）；离子源温度为150℃；脱溶剂气为氮气，气速9.5L/min，温度350℃；锥孔气为氮气，气速1.0 L/min；碰撞气为氩气；其它质谱条件见表1。

1.4 样品前处理

准确称取5 g样品（精确至0.1 mg），加入5 mL磷酸缓冲液（pH=8.0），匀浆后置于50 mL离心管中，加入20 mL乙酸乙酯超声提取20 min，以6 000 r/min离心10 min，收集有机相。再用20 mL乙酸乙酯超声提取2次，合并有机相后，旋转蒸干，加入5 mL磷酸缓冲液（pH=4.5）溶解残渣，再加入5 mL正己烷涡旋振荡去脂，8 000 r/min离心5 min，取下层提取液经MCX固相萃取柱净化，5 mL甲醇洗脱，45℃氮气吹干后1 mL甲醇定容、溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤，供LC-MS/ MS测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，考察0.1%甲酸水-乙腈，0.1%甲酸水-甲醇，5 moL/L乙酸铵（含0.1%甲酸）-甲醇，5 moL/ L乙酸铵（含0.1%甲酸）-乙腈等不同流动相对泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素的分离效果。结果显示：以0.1%甲酸水-甲醇作为流动相，经梯度洗脱后，泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素与杂质峰实现很好的分离，峰形对称，无拖尾和前延现象，响应值高，在5 min内全部出峰，节省了分析时间。猪肉加标样品中泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素MRM色谱图见图1所示。

图1 猪肉加标样品中泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素MRM色谱图Fig.1 Chromatogram of MRM of pleuromulin and 8-α-hydroxypleuromulin

2.2 质谱条件优化

根据目标化合物泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素的结构特征，确定加合H+形成带正电荷的母离子[M+H]+，因此选用ESI+为离子化模式，配制1 μg/mL的泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素标准溶液，采用流动注射泵进样，进行一级质谱扫描，确定准分子离子峰。同时对离子源温度、干燥气温度、雾化器压力等质谱参数进行优化，并以准分子离子采用MRM监测方式进行二级质谱扫描，优化碰撞能量，选择两个信噪比较高的特征子离子作为定量、定性离子对。结果显示：泰妙菌素的准分子离子[M+H]+为m/z 494.3，产生m/z 192.1、119.1的子离子；8-α-羟基泰妙菌素的准分子离子[M+H]+为m/z 337.2，产生m/z 301.0、283.1的子离子，其具体质谱参数见表1。

表1 待测物部分质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of the analytes

2.3 萃取溶剂的选择

根据相似相容原理，泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素偏弱极性，故考察了丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚等不同萃取溶剂对泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素提取效率的影响见图2。

图2 不同萃取溶剂的提取率Fig.2 Extraction rate of different extraction solvents

从图2中可知：按照泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素提取率高低顺序依次为：乙酸乙酯（92.3%）＞二氯甲烷（89.4%）＞丙酮（83.7%）＞乙醚（78.6%），其中乙酸乙酯对泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素提取率最高，提取率分别为91.5%和93.1%，平均值92.3%；虽然乙酸乙酯对泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素的萃取效率最高，可仍有部分油脂被萃取到提取液中，可对LCMS/MS仪器响应值有明显的抑制作用，影响灵敏度，但经正己烷脱脂后，可有效提高其检测响应值，从而提高LC-MS/MS检测灵敏度。故选择乙酸乙酯作为萃取溶剂。

2.4 SPE净化柱的选择

通过样品加标试验，考察不同SPE净化柱（MCX、SCX、C18、HLB、MAX、WAX）对泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素的净化效果见图3。

图3 不同净化柱的净化回收效果Fig.3 Purification and recovery effect of different purification column

结果表明，强阳离子交换柱（MCX和SCX）对泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素的具有较好的净化和浓缩作用，特别是MCX柱净化回收率高达97.2%；弱阳离子交换柱（HLB、C18）回收率适中；而弱阴离子交换柱（MAX和WAX）净化回收率较差。因此，选择MCX固相萃取柱作为净化柱。

2.5 基质效应

基质对目标物的分析可产生显著的干扰，称之为基质效应（Matrix effect，ME），严重的基质效应可直接影响测定结果的准确性，本文研究对象猪肉组织中基质复杂，含有大量的内源性化合物，所以考察了基质效应对LC-MS/MS的影响。在纯甲醇溶液、空白猪肉基质中精确加入一定量的泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素标准溶液，配制成低、中、高3种浓度溶液，按上述所建方法进行测定，比较纯甲醇溶液和猪肉基质中被测组分的峰面积，计算基质效应（ME）=Ap/As，其中Ap指猪肉基质中被测组分的峰面积；As指纯甲醇溶液中被测组分的峰面积；当ME＞1表示存在基质增强效应，当ME＜1表示存在基质抑制效应；M=1表示在曲线范围浓度内基质对响应强度无影响。基质效应ME值见表2。

表2 基质效应ME值Table 2 ME value of matrix effect

从表2中可知：泰妙菌素的基质效应ME值在0.921～0.963，8-α-羟基泰妙菌素的基质效应ME值在0.923～0.984，即表明没有明显的基质增强或抑制效应。

2.6 线性范围与检出限

在猪肉空白样品中，分别加入适量的泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素标准溶液，制备成泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素标准溶液浓度依次为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、500 μg/kg的试样，按上述所建方法进行测定，以色谱峰面积（y）为纵坐标，被测组分的质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数；根据6个空白猪肉样品的基线噪音求其平均值，按信噪比（RS/N=3）计算其方法检测限（LOD），信噪比（RS/N= 10）计算其方法定量限（LOQ）（表3）。结果说明：泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素在加标浓度为5.0 μg/kg～ 500.0μg/kg范围内，相关系数分别为0.9998和0.9997，线性关系良好；LOD分别为1.5 μg/kg和3.0 μg/kg，LOQ分别为5.0 μg/kg和10.0 μg/kg，这说明该方法灵敏度高，低于我国农业部公告第235号中关于动物性食品中兽药最高残留限量要求。线性方程、相关系数、检测限和定量限见表3。

2.7 回收率与精密度

在猪肉空白样品中分别加入线性范围内低、中、高3种浓度的泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素标准溶液，每个浓度平行测定6次，泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素标准溶液的回收率及相对标准偏差（RSD）如表4所示。

表3 线性方程、相关系数、检测限和定量限Table 3 Linear relationship，correlation coefficients，LOD and LOQ

结果表明：泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素的平均回收率为83.4%～97.6%，RSD为2.4%～5.3%，符合兽药残留分析的准确度和精密度要求。

2.8 实际样品的测定

随即选取河北承德市农贸市场销售的各种新鲜猪肉30份，按上述所建方法进行测定猪肉中泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素残留量的测定。结果显示：1份试样中检出含有泰妙菌素（213.8 μg/kg），阳性检出率为3.3%；4份试样中检出含有8-α-羟基泰妙菌素（56.7 μg/kg～314.2 μg/kg），阳性检出率为13.3%；8-α-羟基泰妙菌素阳性检出率高于泰妙菌素阳性检出率，这可能是由于部分猪肉中泰妙菌素经新陈代谢生成8-α-羟基泰妙菌素所导致的。检测结果表明猪肉中存在一定量的泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素残留。

3 结论

本文采用磷酸缓冲液-乙酸乙酯混合提取、水饱和正己烷除脂、MCX柱净化，采用液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）法建立了同时测定猪肉中泰妙菌素及8-α-羟基泰妙菌素残留量的分析方法。结果表明：泰妙菌素和8-α-羟基泰妙菌素在加标浓度为5.0 μg/kg～500.0μg/kg范围内，相关系数分别为0.9998和0.9997，线性关系良好；LOD分别为1.5 μg/kg和3.0 μg/kg，LOQ分别为5.0 μg/kg和10.0 μg/kg；平均回收率为83.4%～97.6%，RSD为2.4%～5.3%，该方法检出限低，精密度好，准确度高，可用于进出口猪肉中泰妙菌素及其代谢产物8-α-羟基泰妙菌素残留量检验检测的要求，并为畜禽食品中泰妙菌素残留量检测方法标准的制修订提供参考。

[1]黄贺贤,曾振灵,黄显会.截短侧耳素类抗生素一泰妙菌素的研究进展[J].中国兽药杂志,2010,44(6)：42-45

[2]汤有志,远立国,刘雅红.截短侧耳素类抗生素的研究进展[J].中国兽医杂志,2012,48(5)：65-68

[3]黄贺贤,曾振灵,黄显会,等.泰妙菌素混悬注射液在猪体内的药物动力学及生物利用度研究[J].中国农业科学,2010,43(10)：2168-2173

[4]Rodger N,M S D.The pleuromutilin antibiotics：a new class for human use[J].Curr Opin Investig Drugs,2010,11(2)：182-191

[5]叶妮,尹晖,王亦琳,等.动物性食品中泰妙菌素残留标志物检测UPLC-MS/MS法研究[J].中国兽药杂志,2016,50(11)：49-53

[6]程林丽,张素霞,沈建忠,等.高效液相色谱法快速检测猪组织中泰妙菌素残留[J].分析化学,2009,37(5)：718-720

[7]张骏豪,谭艾娟,吕世明,等.HPLC法同时检测猪肉中泰乐菌素和泰妙菌素[J].山地农业生物学报,2011,30(1)：87-90

[8]黄雅丽.固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定禽畜和水产品中沃尼妙林和泰妙菌素[J].分析试验室,2010,29(1)：103-106

[9]Siegrid De Baere,Mathias Devreese,An Maes,et al.Quantification of 8-α-hydroxy-mutilin as marker residue for tiamulin in rabbit tissues by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2015,407(15)：4437-4445

[10]耿士伟,朱志谦,曲斌,等.高效液相-串联质谱法测定鸡肉中泰妙菌素残留的研究[J].中国家禽,2012,34(11)：28-33

[11]刘晓茂,李学民,葛娜,等.超高压液相色谱-串联质谱法测定肉类中沃尼妙林和泰妙菌素的残留量[J].食品与发酵工业,2012,38 (8)：182-186

Determination of the Content of Pleuromulin and 8-α-hydroxy-pleuromulin in Pork by LC-MS/MS

FAN Hong
（Chengde Nursing Career Academy，Chengde 067000，Hebei，China）

Extracting by using phosphate buffer and ethyl acetate mixed，and degreasing by n-hexane，and purifying by MCX column，the method was established for determination of the content of pleuromulin and 8-αhydroxy-pleuromulin in pork by liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）.The results showed that the correlation coefficients of pleuromulin and 8-α-hydroxy-pleuromulin were 0.999 8 and 0.999 7 in spiked concentration from 5.0 μg/kg to 500.0 μg/kg，and they had good linear relationsh.The limit of detection（LOD）were 1.5 μg/kg and 3.0 μg/kg，and the limit of quantification（LOQ）were 5.0 μg/kg and 10.0 μg/kg；the average recovery rate were from 83.4%to 97.6%，and relative standard deviations（RSD）were from 2.4%to 5.3%.

pleuromulin；8-α-hydroxy-pleuromulin；liquid chromatography mass spectrometry；pork

2016-11-16

范宏（1976—），女（汉），副教授，硕士，主要从事化学教学及研究工作。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.031