响应面法优化海参多肽脱色工艺

胡庆苹，裴栋，姜红梅，祝潇，魏鉴腾，王宁丽，邸多隆，*

（1.青岛市资源化学与新材料研究中心，山东青岛266100；2.中国科学院兰州化学物理研究所中科院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室，甘肃兰州730000；3.兰州大学公共卫生学

院营养与食品卫生学研究所，甘肃兰州730000；4.蓬莱市疾病预防控制中心，山东烟台265600）

响应面法优化海参多肽脱色工艺

胡庆苹1，2，3，裴栋1，2，姜红梅4，祝潇1，2，魏鉴腾1，2，王宁丽1，2，邸多隆1，2，*

（1.青岛市资源化学与新材料研究中心，山东青岛266100；2.中国科学院兰州化学物理研究所中科院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室，甘肃兰州730000；3.兰州大学公共卫生学

院营养与食品卫生学研究所，甘肃兰州730000；4.蓬莱市疾病预防控制中心，山东烟台265600）

为除去海参多肽中有色物质以利于生物活性肽的分离纯化，经酶解法制备海参多肽酶解液，以脱色率和多肽回收率为评价指标，考察不同脱色剂对海参多肽酶解液的脱色效果，从中筛选出XX型粉末活性炭。在单因素试验的基础上，利用响应面法对脱色条件进行优化。最佳脱色条件为：活性炭用量0.9 g/100 mL，时间32 min，温度50℃，pH2.2，在此条件下，海参多肽液的脱色率达到（85.39±2.25）%，多肽回收率达到（88.57±1.86）%，与理论值无显著差异。

海参多肽；活性炭；脱色；响应面法

海参（Sea cucumber）是棘皮动物门（Echinodermata）海参纲（Holothurioidea）楯手目（Aspidochirota）的无脊椎动物[1]，因其较高的营养及药用价值而被列为“八珍”之一[2]。现代研究表明，海参中主要的功效成分是海参多肽、海参多糖和海参皂苷等[3]。海参多肽是由新鲜海参经蛋白酶解后得到的具有功能特性的生物活性物质[4]，因其溶解性及稳定性好，易吸收，且具有抗氧化[5-7]、降血压[8]、降血脂[9]、提高免疫力[10]、缓解疲劳[11-12]等功能，已成为海参深度开发的重要方向。

海参体壁多为棕色或深褐色，存在大量色素，使其蛋白酶解液，严重影响产品品质，有碍于产品的深度开发。目前常于多肽溶液脱色的脱色剂有：粉末活性炭、颗粒活性炭、硅藻土、大孔吸附树脂、复合吸附剂、弱碱性阴离子树脂、强碱性阴离子树脂、弱酸性阳离子树脂等[13]。

本文采用不同型号和类型的脱色剂对海参酶解液进行脱色工艺研究，以脱色率和多肽回收率为评价指标，筛选合适的脱色剂，考察该脱色剂对海参多肽脱色效果的影响，并运用响应面法对脱色工艺进行优化，为海参多肽的分离纯化及高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

鲜海参：青岛市南山市场；复配蛋白酶（35万U/g～40万U/g）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；粉末活性炭、颗粒活性炭：邵武鑫森炭业有限公司；硅藻土：上海市奉贤奉城试剂厂；氢氧化钠、浓硫酸、无水硫酸铜、乙酸钠、乙酸、乙酰丙酮、37%甲醛、硫酸铵、对硝基苯酚：国药集团化学试剂有限公司；去离子水为中科院西北特色植物资源化学重点实验室自制。

电热鼓风干燥箱、HWS26型电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；Sartorius BSA224S电子天平、Sartorius PB-10 pH计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；台式低速离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；红外智能消化炉：上海沛欧分析仪器有限公司；TU-1810型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

海参→多肽酶解液制备→脱色→离心（4 000 r/ min，5 min）→0.45 μm微孔滤膜过滤→检测上清液

1.2.2 海参多肽酶解液的制备

取鲜海参匀浆，在40℃，加酶量4 000 U/g，时间4 h，PH 6.7，底物浓度为3%的酶解条件下，用复配蛋白酶进行酶解反应得海参多肽酶解液（89.8 g/L）。

1.2.3 脱色率

458 nm处测定脱色前后上清液的吸光度表征色值[13]，按下列公式计算脱色率：

式中：A1为脱色前的吸光度值；A2为脱色后的吸光度值。

1.2.4 多肽回收率

采用Folin-酚法分别测定脱色前后海参多肽溶液中多肽含量[14]，按下列公式计算：

式中：m1为脱色前多肽的含量，g；m2为脱色后多肽的含量，g。

1.2.5 脱色剂筛选

分别考察颗粒活性炭、粉末活性炭和硅藻土对海参多肽的脱色效果，在相同条件下（温度50℃；时间30 min），以脱色率和多肽回收率为评价指标，选择最佳的脱色剂。每种脱色剂分别做3次平行试验，取平均值。

1.2.6 单因素条件确定

准确配置一定浓度的海参多肽溶液于锥形瓶中，分别在不同的活性炭用量、时间、温度、pH值条件下进行脱色处理，结束后离心收集上清液，微孔滤膜过滤后按1.2.3及1.2.4方法测定脱色率及多肽回收率。单因素试验因素及水平表见表1。

表1 单因素试验因素及水平Table 1 Factors and levels of the single factor experiment

1.2.7 响应面试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理[15]，设计四因素三水平响应面试验，见表2。采用Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行分析，建立二次模型，根据模型预测最佳脱色条件并进行验证。

表2 响应面因素设计水平表Table 2 Factors and level value of response surface methodology

2 结果与讨论

2.1 不同脱色剂对海参多肽脱色效果的影响

不同脱色剂对海参多肽脱色效果的影响见图1。

由图1可知，采用粉末活性炭、颗粒活性炭和硅藻土对海参酶解液进行脱色处理，在相同的脱色剂用量、温度和时间下，以粉末活性炭为脱色剂时的脱色率最高，硅藻土为脱色剂时的多肽回收率最高，综合考虑脱色率和多肽回收率，本文选择粉末活性炭作为海参酶解液的脱色剂，这与王书云等[16]在玉米多肽脱色工艺优化研究中选取的脱色剂一致。

图1 不同脱色剂对脱色效果的影响Fig.1 Influence of different bleaching agent on decoloring effect

2.2 单因素试验结果

2.2.1 活性炭用量对脱色效果的影响

不同活性炭用量对海参多肽脱色效果的影响见图2。

图2 活性炭用量对脱色效果的影响Fig.2 Influence of activated carbon concentration on decoloring effect

由图2可知，粉末活性炭用量对海参多肽样品的脱色率有显著的影响，当活性炭用量在0.5 g/100 mL～2.5 g/100 mL的范围内，脱色率随着活性炭用量的增加而升高，但多肽回收率却逐渐降低，可能是由于随着粉末活性炭用量的增加，其比表面积增大，对多肽的吸附能力增强，多肽回收率呈降低趋势。活性炭用量超过1 g/100 mL以后，脱色率上涨趋势变缓，而多肽回收率下降趋势明显。综合考虑脱色率和多肽回收率，选择粉末活性炭用量为1 g/100 mL。这与谢建华等[17]在青钱柳多糖活性炭脱色工艺中的活性炭用量一致。

2.2.2 脱色时间对脱色效果的影响

不同脱色时间对海参多肽脱色效果的影响见图3。

由图3可知，随着脱色时间的延长，海参多肽酶解液的脱色率逐渐增大，然后趋于缓慢，但多肽回收率却呈现降低的趋势。这可能是因为在活性炭脱色过程中，色素和海参多肽竞争吸附活性炭，开始活性炭对色素吸附较强，当达到30 min时色素吸附接近饱和，此时活性炭对多肽的吸附显著增加，致使多肽回收率降低。综合考虑脱色率和多肽回收率，本文选择脱色时间为30 min。这与张璐等[18]在响应面法优化姜脯糖煮液活性炭脱色工艺中的活性炭最佳脱色时间一致。

图3 脱色时间对脱色效果的影响Fig.3 Influence of time on decoloring effect

2.2.3 脱色温度对脱色效果的影响

不同脱色温度对海参多肽脱色效果的影响见图4。

图4 脱色温度对脱色效果的影响Fig.4 Influence of temperature on decoloring effect

由图4可知，在50℃之前，脱色率呈上升趋势，50℃后则呈显著的下降趋势，这可能是由于温度升高，使液体的传质速率增加，分子间扩散加剧，色素易于渗透到活性炭多孔组织的内部，吸附速率增大。当温度高于50℃时，脱色温度过高导致活性炭解吸附速率增加，从而导致脱色率降低。多肽回收率随温度的升高先增加后降低，变化不明显。综合考虑脱色率和多肽回收率，本文选择脱色温度为50℃。这与马光亮等[19]在玉米朊的活性炭脱色工艺研究中的活性炭脱色最佳温度一致。

2.2.4 pH值对脱色效果的影响

不同脱色pH值对海参多肽脱色效果的影响见图5。

由图5可知，随着pH值升高，多肽溶液脱色率不断减小，pH值对活性炭的脱色率具有显著影响，在酸性范围内活性炭的脱色效果较好。这是由于活性炭吸附色素的过程需要H+的参与，所以提高样品中H+的浓度，可以提高脱色率[8]。pH值高于3之后，随着pH值的增加，脱色率呈急速下降趋势，而对多肽的回收率影响不大。综合考虑脱色率和多肽回收率，本文选择3.0为最佳脱色pH值。这与吕振磊等[20]在活性炭对紫贻贝蛋白酶解液脱色效果的影响中的活性炭脱色最佳pH值一致。

图5 pH值对脱色效果的影响Fig.5 Influence of pH on decoloring effect

2.3 响应面法优化海参多肽脱色工艺

2.3.1 响应面优化试验结果

响应面优化试验结果见表3，方差分析结果见表4。由表4可知，该模型Y1和Y2差异极其显著（P＜0.000 1），其决定系数R2值为0.995 4和0.926 4，失拟项P值均＞0.05，表明海参多肽酶解液的脱色率和多肽回收率的试验值和拟合值之间具有很好的拟合度，所构建的Y1、Y2的二次模型合适。

表3 响应面优化试验结果Table 3 Results of response surface experiments

表4 回归模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4回归模型的方差分析可知：Y1的A、C、D、BC、BD、CD、A2、C2、D2对海参多肽溶液的脱色率影响显著。一次项中各因素对海参多肽溶液的脱色率的影响显著性大小顺序是D＞C＞A；Y2的A、C、D、BC、CD、B2、C2对海参多肽溶液的多肽回收率影响显著，一次项中各因素对海参多肽溶液的脱色率的影响显著性大小顺序是C＞A＞D。

拟合后可建立关于活性炭用量、时间、温度以及pH的二次多项式回归模型，为：

Y1/%=86.70+2.08A+0.017B+3.36C-5.54D-0.49AB-0.27AC+0.48AD-0.68BC-1.37BD-2.75CD-1.14A2-0.040B2+0.95C2-6.51D2

Y2/%=88.76-2.16A+0.71B-2.75C+0.83D+ 0.89AB+0.31AC-0.65AD+2.18BC+0.83BD+2.11CD-0.31A2-2.05B2-3.14C2+0.87D2

2.3.2 双因素间交互作用影响

图6 脱色率响应曲面图Fig.6 The response surface plot of the decoloring rate

Y1模型的时间与温度、时间与pH值、温度与pH的两因素间交互作用对海参多肽溶液的脱色率影响见图6。由图6a可知，当活性炭用量和pH值均处于最佳水平时，固定温度50℃左右，脱色率基本不随时间变化；在温度40℃～50℃之间，脱色率随时间增加而缓慢增大；在温度50℃～60℃之间，脱色率随时间增加而缓慢减小。固定时间不变时，脱色率随温度增加有较大幅度的增长。由图6b可知，当活性炭用量和温度均处于最佳水平时，固定时间不变，脱色率随pH值增加先缓慢增加后急速减小。固定pH值在3左右时，脱色率基本不随时间变化；pH值在1～3之间时，脱色率随时间增加而缓慢上升；pH值在3～5之间时，脱色率随时间增加而缓慢下降。由图6c可知，当活性炭用量和时间均处于最佳水平时，固定温度不变，脱色率随pH值增大先缓慢上升后急速下降。pH值不变时，脱色率随温度增加而呈现不同程度的上升。pH值在1～3之间时，脱色率上升显著，而pH值在3～5之间时则上升缓慢。

时间与温度、温度与pH值的两因素间交互作用对海参多肽溶液的多肽回收率影响显著见图7。

图7 多肽回收率响应曲面图Fig.7 The response surface plot of the peptide retention rate

由图7a可知，当活性炭用量和pH值均处于最佳水平时，固定时间不变，多肽回收率随温度增加均呈现先上升后下降的趋势。时间在20 min～30 min之间时，多肽回收率随温度增加先缓慢上升后急速下降；而时间在30 min～40 min之间时，多肽回收率随温度增加先缓慢上升后缓慢下降。固定温度不变，多肽回收率随时间增加均呈现先上升后下降的趋势。温度在40℃～50℃之间时，多肽回收率随温度增加先缓慢上升后缓慢下降；温度在50℃～60℃之间时，多肽回收率随温度增加先急速上升后缓慢下降。由图7b可知，当活性炭用量和时间均处于最佳水平时，固定温度不变，且处于40℃～50℃之间时，多肽回收率随pH值增加呈现先缓慢下降后缓慢上升的趋势；温度在50℃～60℃之间时，多肽回收率随pH值增加呈现急速上升趋势。固定pH值不变，且处于1～3之间时，多肽回收率随温度增加呈现急速下降趋势；pH值处于3～5之间时，多肽回收率随温度增加先缓慢上升后缓慢下降。

2.3.3 海参多肽溶液脱色条件的确定及优化工艺条件验证

经Box-Behnken设计试验可以得到海参多肽液脱色的最佳工艺条件，为：活性炭用量0.9 g/100 mL，时间31.56 min，温度49.77℃，pH 2.18。在此最优脱色工艺条件下，脱色率为87.47%，多肽回收率为88.97%。

为方便操作，将脱色条件设定为：活性炭用量0.9 g/ 100 mL，时间32 min，温度50℃，pH 2.2。在此脱色条件下，脱色率和多肽回收率理论值分别为85.67%和88.62%。采用此脱色条件进行三次平行验证试验，结果为脱色率（85.39±2.25）%，多肽回收率（88.57± 1.86）%，可证明模型可靠。

3 结论

以刺参为原料，经复配蛋白酶酶解得海参多肽酶解液（89.8 g/L），以脱色率和多肽回收率为检测指标，采用响应面法优化海参多肽脱色工艺，考察活性炭用量、时间、温度、pH值对海参多肽溶液脱色效果的影响，以得到海参多肽最佳脱色工艺。在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计方法对海参多肽溶液脱色进行四因素三水平设计，并采用Design Expert 8.0.6对试验数据进行分析处理。试验结果表明，活性炭用量、温度和pH值对脱色率和多肽回收率均具有显著影响。时间与温度、时间与pH值、温度与pH值之间的交互作用对脱色率有显著影响；时间与温度、温度与pH值之间的交互作用对多肽回收率有显著影响。响应面法优化脱色工艺最佳脱色条件为活性炭用量0.9 g/100 mL，时间32 min，温度50℃，pH 2.2。在此最优脱色工艺条件下，脱色率和多肽回收率理论值分别为85.67%和88.62%。3次平行验证试验结果为脱色率（85.39±2.25）%，多肽回收率（88.57±1.86）%，与理论值接近，模型可靠。该脱色工艺简单可靠，脱色效果好，多肽回收率高，为海参多肽产品后期研发提供理论依据。

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Optimization of Decoloring Process of Sea Cucumber Hydrolysates by Response Surface Methodology

HU Qing-ping1，2，3，PEI Dong1，2，JIANG Hong-mei4，ZHU Xiao1，2，WEI Jian-teng1，2，WANG Ning-li1，2，DI Duo-long1，2，*
（1.Center of Resource Chemical&New Material，Qingdao 266100，Shandong，China；2.Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，Gansu，China；3.Institute of Nutrition and Food Hygiene，Faculty of Public Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，Gansu，China；4.Penglai Center for Disease Control and Prevention，Yantai 265600，Shandong，China）

In order to separate and purify the bioactive peptide，the color material of sea cucumber hydrolysates should be removed.The sea cucumber hydrolysates were made by enzyme hydrolysis.Based on the decoloring rate and peptide retention rate detected，the different bleaching agent was investigated，and the XX powder activated carbon was chosen as the best.Based on the results of single factor experiments，the decoloring process was optimized by response surface methodology.The results showed that the optimal conditions were as follows：the amount of activated carbon 0.9 g/100 mL，time 32 min，temperature 50℃，pH 2.2.Under this optimal condition，the decoloring rate was（85.39±2.25）%，the peptide retention rate was（88.57±1.86）%which was not significant with the theoretical value.

sea cucumber hydrolysates；activated carbon；decoloring；response surface methodology

2016-12-13

国家自然科学基金（21605149）；中科院STS项目（KFJSW-STS-146）；青岛市民生计划（15-9-2-97-nsh）

胡庆苹（1989—），女（汉），硕士研究生，研究方向：天然产物研究与开发。

*通信作者

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.016