木聚糖提取优化及对木聚糖酶活性的影响

周义，张东杰，*，李超楠，宋雪健，于果，于金池

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319）

木聚糖提取优化及对木聚糖酶活性的影响

周义1，张东杰1，*，李超楠1，宋雪健1，于果1，于金池1

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319）

以小米糠为试验原料，研究小米糠中木聚糖的提取工艺及对肠道木聚糖酶活力的影响。在单因素的基础上，采用正交试验优化小米糠木聚糖提取工艺，研究料液比、碱提温度、碱液浓度、碱提时间4个因素对提取木聚糖提取率的影响。并采用着色木聚糖标记法测定木聚糖酶活力，研究小米糠木聚糖对大鼠肠道粪便及消化道木聚糖酶活力的影响。结果表明，小米糠木聚糖的最佳提取工艺：料液比为1∶25（g/mL），碱处理温度为100℃，碱液浓度为10%，碱处理时间为2 h，在此条件下木聚糖提取率为21.71%。

小米糠；木聚糖；着色木聚糖标记法；木聚糖酶活性

谷子是我国东北及西北地区主要杂粮作物，种植面积达1 400千亩，年产量370万吨～450万吨[1]。小米糠是由褪下的谷壳、种皮、糊粉层和米胚芽组成，占谷子重量的5%～7%[2]，小米糠作为谷子加工过程中产生的副产物之一，是一种产量较高的可再生资源，并含有丰富的营养成分，如蛋白质、维生素、脂肪、矿物质和膳食纤维等。但由于小米糠的外观差、有异味和缺乏可食性等原因，使小米糠在实际应用中主要被用作动物的饲料，这样不仅造成了资源的严重浪费，而且对环境还会产生不良影响[1-3]。为提高小米糠的利用价值，研究从小米糠中提取木聚糖的工艺具有一定的研究意义。目前，从农作物中提取木聚糖的方法主要有超声波辅助法[4]、超声处理结合蒸煮法[5]、碱性过氧化氢[6]等，但由于这些方法并不成熟，现还以碱提-蒸煮法为主。植物组织内天然结构的木聚糖受到木质素的屏蔽而很难被酶解。即使在牛科动物瘤胃中木聚糖的消化率也只有36%～79%[7]，人体肠胃对木聚糖的消化率并没有人直接检测过。然而，提纯后的木聚糖可解除木聚糖的屏蔽[8]。本文以正交试验优化蒸煮-碱提取法提取小米糠中木聚糖工艺条件，并建立以木聚糖作为日常饮食干预的大鼠模型，并用染料法测定大鼠粪便的木聚糖酶酶活性变化。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

小米糠：大庆市农贸市场；D-木糖、木二糖、木三糖标准品（纯度＞99%）：日本和光纯药工业株式会社；木聚糖酶（酶活6000 IU/mL）：诺维信生物技术有限公司；健康雄性SD大鼠（SPF级）：大连医科大学实验动物中心；气巴蓝：西宝生物科技股份有限公司；1.4-丁二醇二环氧甘油醚、葡萄糖、无水乙醇、氢氧化铵、浓硫酸等：天津市大茂化学试剂；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器设备

TD4A离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；722S可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱、DK-S12型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；DELTA320型酸度计：梅特勒—托制多仪器（上海）有限公司；TDZ5-WS台式离心机：湘仪离心机仪器有限公司；T6紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

2 试验方法

2.1 小米糠提取木聚糖的工艺流程

小米糠→粉碎过80目筛→加水蒸煮→乙醇浸提→离心机离心→碱处理→离心→取上清液→中和沉淀→离心→取上清液→乙醇沉淀→离心→蒸馏水洗涤→干燥→木聚糖

工艺要点：将小米糠水洗干净，干燥，用高速粉碎机粉碎，然后过80目的筛子备用。称取2.0 g小米糠，加入12 mL的水，在90℃蒸煮1.5 h后，用3倍体积即36 mL的工业酒精浸泡12 h、过滤并水洗滤渣得沉淀，按不同的料液比在沉淀中加入一定浓度的NaOH，在一定温度下提取后离心，得到上清液用6 mol盐酸调pH值至5，静置12 h，离心得沉淀A留用，而上清液中则加入3倍体积工业酒精静置1.5 h离心得沉淀B。将A，B沉淀混合干燥24 h即得到木聚糖。

2.2 木糖标准曲线的绘制

DNS法制备标准曲线，将6.3 g的DNS和2 mol/L NaOH 262 mL溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g亚硫酸钠和5 g结晶酚。冷却后加蒸馏水定容至1 000 mL，保存备用；配制1 mg/ mL标准木糖溶液；绘制标准曲线：吸取1 mg/mL标准糖液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20分别于25 mL具塞试管中，加1.8 mL蒸馏水和3 mLDNS试剂，于沸水浴中保温5 min显色，迅速冷却，加入20 mL蒸馏水，测定糖液520 nm处的吸光值，绘制标准曲线[9]。

2.3 小米糠提取木聚糖单因素试验

2.3.1 碱液浓度对木聚糖提取率的影响

精准称取2.0 g小米糠，分别加入6倍体积水，在90℃下蒸煮1 h后，分别采用5%、10%、15%、20%的NaOH溶液，料液比为1∶20（g/mL），在温度90℃下加热提取1.5 h，醇沉时调节pH值为5，干燥后称取木聚糖质量，计算木聚糖的提取率。

2.3.2 料液比对木聚糖提取率的影响

准确称取2.0 g小米糠，加入6倍体积水，90℃下蒸煮1 h后，采用10%NaOH溶液，料液比分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），在温度90℃下加热提取1.5 h，醇沉时调节pH值为5，干燥后称取木聚糖质量，计算木聚糖的提取率。

2.3.3 碱提温度对木聚糖提取率的影响

准确称取2.0 g小米糠，加入6倍体积水，90℃下蒸煮1 h后，采用10%NaOH溶液，料液比1∶20（g/ mL），在温度70、80、90、100℃下加热提取1.5 h，醇沉时调节pH值为5，干燥后称取木聚糖质量，计算木聚糖的提取率。

2.3.4 碱提时间对木聚糖提取率的影响

准确称取2.0g小米糠，加入6倍体积水，90℃下蒸煮1 h后，用10%NaOH溶液，在90℃温度下分别提取0.5、1、1.5、2 h，料液比1∶20（g/mL），醇沉时调节pH值为5，干燥后称取木聚糖质量，并计算木聚糖的提取率。

2.3.5 小米糠木聚糖提取工艺优化试验

在单因素试验基础上，选用L9（34）正交试验设计表，以碱提浓度（A）、料液比（B）、碱提温度（C）、碱提时间（D）为影响因素，以木聚糖提取率为指标，优化提取工艺参数。因素水平见表1。

表1 L9（34）正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

2.4 小米糠木聚糖对大鼠肠道木聚糖酶活性的影响

2.4.1 大鼠分组与饲养

取20只健康雄性SD大鼠，适应性饲养1周，以体重为指标，将20只大鼠随机分为木聚糖组和正常组，每组10只，每笼5只。木聚糖组在饲料中添加2.38 g/（kg·d）的木聚糖，正常组在饲料中以等量水替代木聚糖。饲喂期间大鼠可自由饮水。饲料配方：豆粉26%+面粉20%+玉米粉20%+麸皮16%+其他18%[10]。

2.4.2 小米糠木聚糖交联着色

将小米糠木聚糖2 g加入30 mL蒸馏水，浸润后加入10 mL的2 mol/LNaOH溶液溶解，然后加入1.5 g气巴蓝，1.2 mL 1，4-丁二醇二环氧甘油醚，搅匀，静置48 h后形成弹性极好的凝胶。将凝胶捣碎成细小颗粒，沸水反复冲洗至洗出液无色。凝胶颗粒依次用25%、50%、75%、95%乙醇洗涤脱水，最后用丙酮，石油醚处理，80℃真空挥干石油醚后得深蓝色粉末状气巴蓝-蔗渣木聚糖不溶性固体染料[11]。

2.4.3 气巴蓝着色木聚糖染料法测定酶活力

用pH5.0，0.005 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，按照终浓度为6%进行配制气巴蓝着色小米糠木聚糖悬浮液。取气巴蓝着色小米糠木聚糖悬浮液3.8 mL，并分别加入酶活力为0.04、0.08、0.12、0.16 IU/mL的木聚糖酶0.2 mL，60℃振荡保温10 min，加入10%NaOH终止反应，4 000 r/min离心5 min，在625 nm处测定吸光值，建立木聚糖酶活力与气巴蓝着色小米糠木聚糖吸光值的标准曲线。

2.4.4 鼠便木聚糖酶酶活力测定

采用逼迫法采集大鼠新鲜粪便样品，并立即放入-20℃环境中保存。由于每天鼠便的酶活性有可能存在差异，因此，将每周鼠便样品测定的木聚糖酶活力进行核算。

小鼠粪便酶活力测定：称取粪便样品，加入20倍纯水，捣碎，再加入过量的气巴蓝木聚糖作为底物，37℃保温3.5 h，每0.5 h振荡一次，反应结束后立即离心（16 000 r/min，10 min），取1 mL上清液定容至3 mL，测定625 nm处吸光值，按下式计算粪便中的木聚糖酶活力（IU/g）。

式中：Y1为酶活力，IU/mL；20为样品稀释倍数；3为反应液检测稀释倍数；3.5为反应时间，h；60为h换算为min；10为（1）式的反应时间，min。

2.4.5 大鼠不同肠段小米糠木聚糖降解率的测定

大鼠饲喂7周后用正常饲料代替气巴蓝小米糠木聚糖饲料，饲喂1周，采用颈椎脱臼法处死大鼠，快速解剖，收集大鼠空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠新鲜内容物，加入2倍水振荡均匀，浸泡5 min，16 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液定容至3 mL，测定625 nm处吸光值[10]。

2.5 数据统计方法

试验数据均以均值±标准差即MS±SD表示，采用SAS 9.1统计学软件进行统计分析，P＜0.05表示具有统计学意义，Origin 8.5软件绘制相关图表。

3 结果与分析

3.1 木聚糖标准曲线

木聚糖标准曲线见图1。

图1 木聚糖标准曲线Fig.1 Xylose standard curve

由图1可知，木聚糖标准曲线的线性回归方程y= 0.870 9x-0.007 8，其中R2=0.998 9，说明标准曲线拟合较好，可用于后续试验。

3.2 小米糠木聚糖单因素试验结果

3.2.1 碱液浓度对小米糠木聚糖提取率的影响

碱液浓度对小米糠木聚糖提取率的影响见图2。

图2 碱液浓度对小米糠木聚糖提取率的影响Fig.2 Effect of alkaline concentration on extraction rate of mittle bran

由图2可知，小米糠木聚糖的提取率随着碱液浓度的升高呈现先升高后降低的趋势，并在碱液浓度为10%时提取率达到最高为19.15%。这是因为碱液浓度较低时，对小米糠的透壁作用较差导致木聚糖的提取率较低，但是当碱液浓度较高时会造成木聚糖的分解从而引起提取率降低。因此选取碱液浓度为5%、10%、15%作为正交试验水平。

3.2.2 料液比对小米糠中木聚糖提取率的影响

料液比对小米糠木聚糖提取率的影响见图3。

图3 料液比对小米糠木聚糖提取率的影响Fig.3 Effect of material/liquid ratio on the extraction rate of xylan from wheat bran

由图3可知，小米糠木聚糖的提取率随着提料液比的升高呈现先升高再降低的趋势，并在料液比为1∶25（g/mL）时提取率达到最高为21.31%。这是因为所用溶剂越多，被浸提出的物质就越多，而当扩散达到平衡时，再增加溶剂量也不会使浸出物质增加[11]。因此选用料液比为1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）作为正交试验水平。

3.2.3 碱提温度对米糠木聚糖提取率的影响

碱提温度对小米糠木聚糖提取率的影响见图4。

图4 碱提温度对小米糠木聚糖提取率的影响Fig.4 Effect of alkaline temperature on extraction rate of mittle bran

由图4可知，小米糠木聚糖的提取率随着提取温度的升高呈现先升高后降低的趋势，并在提取温度为90℃时提取率达到最高为19.58%。这是因为温度较低时，料液中的分子运动较慢导致小米糠内木聚糖往溶液中扩散提取较慢而使提取率较低，但温度过高时有可能会导致部分木聚糖分解而引起提取率降低。因此选择碱提温度为80、90、100℃作为正交试验水平。

3.2.4 碱提时间对小米糠中木聚糖提取率的影响

碱提时间对小米糠中木聚糖提取的影响见图5。

图5 碱提时间对小米糠中木聚糖提取的影响Fig.5 Effect of alkaline time on extraction of xylan from millet bran

由图5可知，小米木聚糖的提取率随着碱提时间的升高呈现先升高后降低的趋势，并在碱提时间为1.5 h时提取率达到最高为19.93%。这是因为碱提时间较短时，对小米糠中木聚糖的提取不充分导致木聚糖提取率较低，但碱提时间过长时溶液中的杂质溶出较多引起提取率降低。因此选取碱提时间为1.0、1.5、2.0 h作为正交试验水平。

3.3 小米糠木聚糖提取工艺的正交优化试验

在单因素试验的结果基础上，选择碱提浓度、料液比、碱提温度、碱提时间设计成四因素三水平的正交试验表，以小米糠木聚糖的提取率为指标，按照正交表L9（34）进行正交试验。正交试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

由表2、表3可知，4个因素对小米糠木聚糖提取率影响的主次顺序为C＞B＞A＞D，即碱提温度＞料液比＞碱提浓度＞碱提时间，且碱提温度、料液比、碱提浓度和碱提时间对小米糠木聚糖提取率均为极显著影响。由正交试验表得出最佳优化工艺组合为A1B2C3D3，即碱提温度100℃，料液比为1∶25（g/mL），碱液浓度为10%，碱提时间2 h，该组合不在正交试验之列，通过验证试验该组合提取率21.71%。

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance results

3.4 木聚糖对大鼠肠道木聚糖酶活性的影响

3.4.1 气巴蓝酶活力和吸光值关系曲线

木聚糖酶酶活力与染料释放量（OD625nm）关系见图6。

图6 木聚糖酶酶活力与染料释放量（OD625nm）关系Fig.6 The relationship between xylanase activity and dye release（OD625nm）

由图6可知，木聚糖酶酶活力与染料释放量（OD625nm）之间的标准曲线回归方程为y=1.902 8x-0.013 6，R2=0.997 4，说明染料释放量（OD625nm）与木聚糖酶酶活力具有良好的正相关性。

3.4.2 小米糠木聚糖对大鼠粪便木聚糖酶活性的影响

饲料中添加木聚糖对鼠便木聚糖酶活性的影响见图7。

木聚糖酶是一种诱导酶，只有存在于木聚糖环境的微生物才会分泌此种酶。由图7可知，从第二周之后的正常组的木聚糖酶活力明显低于木聚糖组，正常组鼠便能检测到一定的木聚糖酶活力是因为基础饲料中款皮（约19.42%）含有一定量的木聚糖。而两组大鼠粪便的木聚糖活性均在饲养5周之后进入高峰，其原因可能是：木聚糖促使大鼠肠道产酶微生物增殖，或菌群整体产酶水平的提高，至少需要5周以上时间的诱导才能达到高峰，木聚糖组鼠便的酶活性（3.461 IU/g）已经升高到饲喂起点的24倍，比同期正常组的酶活性（0.125 IU/g）也提高了6.8倍，此后基本趋于稳定。

图7 饲料中添加木聚糖对鼠便木聚糖酶活性的影响Fig.7 Effect of adding xylan on feed xylanase activity

3.4.3 鼠不同肠段木聚糖降解率

大鼠不同肠段降解着色木聚糖的活性见图8，着色木聚糖在大鼠不同肠段的降解率见图9。

图8 大鼠不同肠段降解着色木聚糖的活性Fig.8 The activity of stained xylan in different intestinal segments of rats

图9 着色木聚糖在大鼠不同肠段的降解率Fig.9 Degradation rate of colored xylan in different intestinal segments of rats

以吸光值表示染料的相对含量，代表不溶性气巴蓝着色木聚糖到达不同阶段之后的酶解程度（图9）。以直肠段释放的染料含量为100%，表示木聚糖达到此肠段的水解率己经达到100%，则到达盲肠段、结肠段木聚糖的水解率分别达到60%、85%，在小肠段（空肠、回肠）酶解的木聚糖不到摄入总量的10%。由此得出，大肠是木聚糖的主要水解场所，且盲肠水解木聚糖占大肠水解木聚糖的60%左右，之后有不到20%的木聚糖到直肠段才水解，这表明，小米糠木聚糖几乎可以送到肠道的最远端供微生物发酵利用。

4 结论

在小米糠提取木聚糖试验中，通过正交试验优化小米糠中木聚糖的提取工艺，得到最佳提取条件：碱处理温度为100℃，料液比为1∶25（g/mL），碱液浓度为10%，碱处理时间为2 h，在此条件下木聚糖提取率为21.71%。

采用不溶性气巴蓝标记小米糠木聚糖对胃肠木聚糖酶活性进行研究，结果表明小米糠木聚糖可显著提高大鼠肠道粪便的木聚糖酶活力，并且需要5周以上时间的诱导才能达到高峰，并与正常组相比木聚糖酶活力显著提高，此后基本趋于稳定，并且几乎可以送到肠道的最远端供微生物发酵利用。

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Extraction of Xylan and Its Effect on Xylanase Activity

ZHOU Yi1，ZHANG Dong-jie1，*，LI Chao-nan1，SONG Xue-jian1，YU Guo1，YU Jin-chi1
（College of Food Science，Heilongjiang BaYi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China）

Small rice bran as raw material testing，research in rice bran extraction process small impact on the xylan and xylanase activity of the intestinal tract.On the basis of single factor，orthogonal experiment was used to optimize the extraction process of millet bran chitosan.The effects of four factors，such as ratio of material to liquid，alkali temperature，alkali concentration and alkali extraction time，on the extraction process were studied.And the xylanase activity was measured by the method of coloring xylan labeling to study the effects of millet chaffidan on intestinal fecal and xylanase activity in digestive tract.The results showed that the best extraction process was as follows：the ratio of material to liquid was 1∶25（g/mL），the alkali treatment temperature was 100℃，the alkali concentration was 10%，the alkali treatment time was 2 h，and the xylan was rate of 21.71%.

millet bran；xylan；coloring xylan labeling method；xylanase activity

2017-04-28

周义（1992—），男（满），研究生，研究方向：农产品加工及贮藏工程。

*通信作者：张东杰（1966—），男，教授，博士，研究方向：农产品加工与安全。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.015