云南84个玉米杂交种的SSR遗传多样性分析

胡德分，胡晓莉,2*，杨绍林，李 阳，吴 彬，赵自仙**，杨 久

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.陇川县农业局，云南 陇川 678700；3.开远市植检植保站，云南 开远 661600；4.云南省农业科学院粮食作物研究所，云南 昆明 650205)



云南84个玉米杂交种的SSR遗传多样性分析

胡德分1，胡晓莉1,2*，杨绍林1，李 阳1，吴 彬3，赵自仙1**，杨 久4**

(1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.陇川县农业局，云南 陇川 678700；3.开远市植检植保站，云南 开远 661600；4.云南省农业科学院粮食作物研究所，云南 昆明 650205)

【目的】通过对云南84个玉米杂交种的遗传多样性进行分析，为云南玉米育种提供参考依据，提高育种效率。【方法】利用SSR分子标记技术和UPMGA方法对试验材料进行分析。【结果】筛选出均匀分布在玉米10条染色体上的61对SSR标记引物对供试材料进行SSR标记，共检测到622个等位基因变异，每对引物2～22个等位变异位点，平均为10.23个；每对引物的多态信息量(PIC)在 0.324～0.920，平均为0.779，相似系数在0.662～0.918；以0.745为界，将84份供试杂交种划分为5大类群，以0.753为界，将类群Ⅰ划分为4个亚群，84.5 %的杂交种均聚在类群Ⅰ。【结论】试验表明云南玉米杂交种遗传基础较狭窄，杂交种间具有同质化趋势。

云南；玉米杂交种；SSR；遗传多样性

【研究意义】玉米属于禾本科(Gramineae)玉蜀黍族(May,deae)，是典型的异花授粉作物，表现极端的近交衰退和杂种优势[1]。20世纪杂交种的出现是中国玉米生产的一次革命，是中国玉米产量大幅提升的关键因素。云南是全国15个玉米主产区之一，位于中国玉米带的西南端[2]。地处低纬高原，海拔相差大，地势错综复杂，有高原、丘陵、盆地、山地及河谷，具有多样的生态系统和丰富的小气候带。云南是国内玉米地方种质资源最丰富的省份，据2007年姚启伦统计，云南地方种质资源共1896份[3]。云南种植的玉米籽粒类型有硬粒型、半马齿型、马齿型、甜质型、糯质型、爆裂型和甜粉型7种[4]。2008年云南省玉米播种面积113.33万hm2，首次超过水稻，成为云南省种植面积最大的粮食作物[5]；2013年云南玉米播种面积为150.51千hm2，在全国排列第9位，年总产量734.2万t，在全国排列第10位，在西南6省(市、自治区)中仅次于四川而位居第二，云南玉米生产对提高中国的玉米产量起着重要作用。遗传多样性(Genetic diversity)是生物多样性的重要组成部分，又称为基因多样性，广义指地球上生物所携带的各种遗传信息的总和。狭义指种内不同群体和个体间的遗传多样性的程度，或称遗传变异[6]。作物遗传多样性分析的方法，有形态标记、细胞学标记、生化标记等。【前人研究进展】Helentjaris于1986采用RFLP技术构建了玉米第一张遗传图谱[7]。刘新芝等利用RAPD分子技术对17个玉米品种进行类群的划分，分子技术逐渐被广泛用于遗传多样性分析。SSR标记技术因具有多态性高、呈共显性、对DNA质量要求不高和重复性好、实验程序简单等优点，在遗传多样性研究中很受研究者的青睐，王春梅[8]利用SSR对贵州270份玉米地方种质资源进行标记，采用UMPGA聚类划分为6大类，与供试材料的地理来源和系谱一致，6大种质类群各自与其代表系单独成类。此外，对水稻、玉米、番茄等作物的研究表明，SSR标记在检测亲缘关系较近的品种间表现出遗传差异的效率高于RFLP、RAPD，且分类结果与系谱有较好的一致性[9-13]。了解并分析云南省玉米杂交种遗传基础，对云南省玉米种质扩增、改良和创新利用具有重要意义。李俊芳[14]研究表明，利用SSR技术对杂交种进行聚类分析可以客观地评价当地玉米种质基础的现状。【本研究切入点】本研究采用SSR分子标记技术，对云南省的84个玉米杂交种进行遗传多样性分析和类群划分。【拟解决的关键问题】明确云南省玉米杂交种的遗传基础，为云南省玉米育种提供参考，提高育种效率。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料84份基本情况见表1。其中编号1～58从云南玉米主要种植区收集(包括云南大面积种植的主推品种)，编号59～84是玉米新组合，由云南农业大学农学与生物技术学院赵自仙老师提供。

表1 84份云南玉米杂交种

续表1 Continued table 1

材料编号No．材料名称Name材料编号No．材料名称Name材料编号No．材料名称Name22正大81950云瑞6号7813正组⁃105×8323胜玉5号51西辽正交7913正组⁃11×124路单12号52西辽反交8013正组⁃108×8325红单6号53珍禾2号8113正组⁃35×126同玉1154珍禾898213正组⁃107×8327鄂玉10号55正兴5号8313正组⁃100×8328云优10556珍禾998413正组⁃18×1

1.2 实验方法

1.2.1 DNA的提取 室内恒温箱沙床培养玉米种子，待玉米生长到3叶1心时，每个杂交种平均取5株的新鲜叶片混合，参照Saghai-Maroof等[15](1984)提出的CTAB法，提取并纯化基因组DNA，纯化试剂为聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、β-巯基乙醇。

1.2.2 SSR引物筛选 结合玉米数据库MaizeGDB已公布的1900对引物和前人的研究经验，选择120对引物，根据多态性高、重复性好、条带丰富的原则筛选均匀分布于玉米10条染色体上的61对SSR标记引物。引物由上海捷瑞生物有限公司合成，引物详细信息见表2。

表2 61对SSR引物扩增等位基因数及多态信息量

续表2 Continued table 2

SSR引物SSRPrimer图谱位点Binnumber等位基因变异数NumberofvariantallelesPICSSR引物SSRprimer图谱位点Binnumber等位基因变异数NumberofvariantallelesPICphi1091885．03150．874phi0316．0440．731phi0875．06110．846phi0786．0580．695phi0855．06110．806phi1236．0760．748umc11535．09100．786phi2998526．07100．841umc11436．0060．678phi0896．0870．798phi4237966．01120．718umc15457．00110．852等位基因变异数NumberofVariantAllelesPIC平均值10．230．779

1.2.3 PCR扩增体系及程序 PCR扩增反应体积为15 μl，其中模板DNA：1 μl；10×PCR buffer：1.5 μl；25 mM Mg2+：0.9 μl；10 mM dNTPs：0.3 μl；0.01mM Primer：0.6 μl；5 U/μlTaq酶：0.225 μl；ddH2O：9.875 μl，反应成分均购于上海生工有限公司。PCR扩增程序为：第一步94 ℃预变性4 min；第二步94 ℃变性1 min，47～60 ℃引物与模板靶位点结合45 s，72 ℃延伸1 min，32个循环；第三步72 ℃延伸10 min；第四步4 ℃保存备用。

1.2.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 配制8 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶，产物与6×loading buffer混合，于50 W恒功率条件下，电泳1 h 30 min，分离PCR扩增产物。低速水平摇床上银染显色，其染色步骤为：ddH2O漂洗2次，30 s；0.2 %硝酸银+10 %无水乙醇+1 %冰乙酸，固定染色10 min；ddH2O漂洗2次，30 s；1.5 %氢氧化钠+2.5 %甲醛，显色，直到条带清晰停止；ddH2O漂洗1次，10 s；10 %冰乙酸固定10 min，ddH2O漂洗1次，照相。

1.2.5 SSR数据统计与分析 每个条带代表一个标记位点的一个等位基因，在相同迁移位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，进行数据统计。参照 Smith[16]所提出的公式计算 SSR 标记位点的多态性信息量(Polymorphic Information Content，PIC=1-∑Pi2计算，Pi为i位点的基因频率。SSR为共显性标记，以Jaccard系数计算杂交种间的遗传相似系数(Genetic Similarity，GS)，即GS(jk)=a/(a+b+c)，其中a指的是j和k共有的位点数；b代表j有而k无的位点数；c指的是k有而j无的位点数[17]。利用 NTSYS-2.10 e和Excel 2013软件，根据杂交种间SSR遗传相似系数(GS)矩阵，按UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Average )法进行遗传距离聚类分析，构建UPGMA树状图[18]。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的检测

配制1 %的琼脂糖检测基因组DNA的质量，检测结果见图1。挑选DNA检测条带亮、无拖尾的用于后续试验。

2.2 SSR标记结果

对扩增条带(图2)进行统计分析，如表2所示，61对SSR引物对云南的84份玉米杂交种进行PCR扩增后，共检测到624个等位位点的变异，每对引物检测到2～22个等位变异位点，平均为10.23个。每对引物的多态信息量(PIC)在 0.324～0.920，平均为0.779。引物phi374118的PIC值最小，为0.324；引物phi102228的PIC值最大，为0.920。84份玉米杂交种的相似系数在0.662～0.918，其中北玉16与安单3号遗传距离最大，二者相似系数为0.662；西辽正交与西辽反交最为相似，相似系数达到了0.918。

2.3 聚类结果

采用NTSYS-2.10e软件对云南省84份玉米杂交种聚类分析。聚类分析结果见表3，聚类树状图见图3。以相似系数0.745为界，84份玉米杂交种可划分为5大类，类群Ⅰ包括71份材料，占供试材料的84.5 %，以 0.753为界，将Ⅰ类群又划分为4个亚群，亚群Ⅰ-1有67个供试材料，占供试材料的79.8 %，占Ⅰ类群的94.4 %。云南省种植面积比较大的品种中，五谷1790、云瑞8号、云瑞6号、奥玉3202、云瑞999、珍禾2号、胜玉5号、红单6号、正大819、长城799、会单4号、兴黄单892、云瑞88、靖丰8号、胜玉2号、云优105、安单3号、云瑞6号、保玉7号、正大615、珍禾99、足单707、中单808、迪卡2号等都集中在第Ⅰ类群，其中又以Ⅰ-1亚群最多，特别是目前云南种植面积最大、最有影响力的3个品种(会单4号、兴黄单892、路单8号)，也在类群Ⅰ，表明它们的遗传关系较近。

此外，26个玉米新组合有20个集中在Ⅰ-1亚群，占新组合总数的76.9 %。楚白单4号、盐墨23聚在第Ⅳ类群；北玉20、北玉16号、海禾1号、海禾2号聚在第Ⅴ类群。大面积种植品种中，只有第Ⅳ、第Ⅴ类群的6个品种与第Ⅰ类群的遗传关系较远。可见，云南省现阶段生产上种植的玉米杂交种和新育成的组合均具有较强的同质化趋势，云南玉米品种的遗传基础比较脆弱。

图1 1 %琼脂糖凝胶检测DNAFig.1 DNA detected by 1 % agarose gel

3 讨 论

采用SSR技术从分子水平分析玉米遗传多样性避免了环境因素对试验结果的影响，使试验结果更具可靠性。SSR 标记检测到的是一个单一的多等位变异基因位点，符合孟德尔遗传规律[19]。因此，某对 SSR 引物可能是某个等位基因位点的特异标记，根据特异性标记可分析出种质的遗传多样性。Smith和Russel等研究表明，分析亲缘关系较近的品种间的遗传差异，SSR标记表现出遗传差异的效率高于RAPD、RFLP[3]。本试验采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳通过银染显色检测，该方法与变性聚丙烯酰胺凝胶相比，分辨率虽有所下降，但降低了试验成本与危险性，且分辨率高于琼脂糖凝胶，8 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶能满足玉米遗传多样性的分析研究。

第1幅图从左往右为Marker，1～43，Marker，第25孔废掉；第2幅图从左往右为Marker，43～84，MarkerThe first fig from left to right is Marker, 1-43, Marker, and 25th is useless. The second fig from left to right is Marker, 43-84, Marker图2 引物phi056电泳结果Fig.2 The electrophoresis of primer 056

类群Groups亚群Sub⁃groups材料名称ThenameofmaterialsⅠⅠ⁃158：云单14号；48：安单3号；43：保玉7号；50：云瑞6号；83：13正组⁃100×83；80：13正组⁃108×83；82：13正组⁃107×83；79：13正组⁃11×1；64：13正组⁃101×83；70：13正组⁃46×36；62：13正组⁃104×83；78：13正组⁃105×83；72：13正组⁃89×83；74：13正组⁃93×83；61：13正组⁃97×83；31：路单8号；63：13正组⁃55×36；60：13正组⁃45×36；73：13正组⁃106×83；71：13正组⁃64×36；75：13正组⁃44×36；66：13正组⁃62×36；65：13正组⁃63×36；69：13正组⁃102×83；59：13正组⁃43×36；39：奥玉3202；56：珍禾99；47：云瑞999；54：珍禾89；53：珍禾2号；52：西辽反交；51：西辽正交；55：正兴5号；46：家佳荣2号；27：鄂玉10号；26：同玉11；23：胜玉5号；28：云优105；25：红单6号；22：正大819；5：康农玉901；44：YR12；45：云瑞8号；19：足单707；2：正红311；30：楚玉1号；29：云瑞88；12：桂单0810；40：长城799；37：兴黄单892；35：会单4号；6：中单808；7：迪卡2号；20：临奥9号；3：天玉168；32：路单6号；1：资玉二号Ⅰ⁃213：昌隆98；14：雅玉88；16：靖丰8号；49：胜玉2号；17：丁单1号；38：五谷1790Ⅰ⁃34：雅玉78；21：正大615；18：金卡879；8：山州2011；9：雅玉719；10：田丰8号；24：路单12号Ⅰ⁃411：雅玉889Ⅱ57：13鉴57Ⅲ67：13正组⁃16×1；68：13正组⁃15×1；81：13正组⁃35×1；84：13正组⁃18×1Ⅳ15：楚白单4号；33：盐墨23；76：13正组⁃278×262；77：13正组⁃277×262Ⅴ34：北玉20；41：海禾1号；42：海禾2号；36：北玉16号

图3 84个玉米杂交种的UPGMA聚类结果Fig.3 UPGMA clustering dendrogram of 84 maize hybrids

对于云南玉米种质多样性的研究，主要集中在地方品种[3]、骨干自交系[20]及糯玉米[21]方面，有关云南玉米杂交种遗传基础的研究未见报道。分析云南省玉米杂交种的遗传基础，一定程度上能反应出目前云南省玉米种质的利用情况。本研究用61对SSR引物对84份玉米杂交种进行分析得出，每对引物的PIC值平均为0.779，平均等位变异基因数为10.223，相似系数在0.662～0.918，等位变异数和PIC平均值远高于葛建镕等[22]对吉林省主推的44个玉米品种遗传多样性的研究结果(4.91个，0.689)，也高于姚启伦等[23]对15个云南玉米群体平均等位变异数(6.3)和PIC平均值(0.77)，表明本研究筛选的SSR引物多态性好，供试的84份杂交种遗传多样性比吉林省的44个主推玉米品种和云南省的15个玉米群体丰富。

结合杂交种的系谱分析可知，雅玉719、雅玉889、雅玉88、雅玉78的母本相同，为7854，4个品种均聚在类群Ⅰ-2、Ⅰ-3；路单8号、会单4号的父本均为掖107，聚在类群Ⅰ-1；云瑞6号、云瑞8号、云瑞88的父本也相同，为YML107，3个品种聚在类群Ⅰ-1；北玉20、海禾1号、海禾2号、北玉16号均聚在类群Ⅴ；同父异母的多个新组合也聚在同一类群；西辽正交和西辽反交均聚在类群Ⅰ-1，且遗传关系最近。说明用SSR分析方法，其衍生系品种及同父异母、同母异父的品种或组合均聚在同一类群，表明本研究的SSR分析结果与系谱高度一致，结果可靠。

然而，84个供试材料中，84.5 %的杂交种(其中包括云南种植面积最大的3个品种会单4号、兴黄单892、路单8号)均聚在类群Ⅰ，推广品种中只有楚白单4号、盐墨23、北玉20、北玉16号、海禾1号、海禾2号6个品种被划分在其它类群，说明云南种植玉米杂交种的遗传基础比较狭窄，同质性较严重。

4 结 论

利用SSR分子标记对玉米种质进行遗传多样性分析，结果与系谱基本一致。研究结果表明，云南省广泛种植的玉米杂交种和新育成的组合具有丰富的多态性，但相互的遗传距离偏低，具有较强的同质化趋势，遗传基础比较脆弱，影响着云南省玉米产量的持续稳定及提高。加强外来玉米种质的引进、利用，充分挖掘地方种质资源，进行种质扩增、改良和创新，创建新的玉米杂种优势模式，是今后云南省玉米育种的重要方向。

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(责任编辑 王家银)

Genetic Diversity of 84 Maize Hybrids Based on SSR Markers in Yunnan

HU De-fen1, HU Xiao-li1,2*, YANG Shao-lin1, LI Yang1, WU Bin3, ZHAO Zi-xian1**, YANG Jiu4**

(1.College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Yunnan Kunming 650201, China; 2.Agricultural Bureau of Longchuan County, Yunnan Longchun 678700, China; 3.Kaiyuan Plant Quarantine and Protection Station, Yunnan Kaiyuan 661600, China; 4.Institute of Food Crops, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650205, China)

【Objective】The objective of this study is to provide the reference, and to improve efficiency for Yunnan maize breeding through the analysis of genetic diversities of 84 maize hybrids in Yunnan. 【Method】The test materials were analyzed by SSR markers and UPMGA method. 【Result】61 pairs of primers which are uniformly distributed on 10 maize chromosomes were screened, totally 622 allelic variations were detected from the experimental materials by 8 % non-denaturing polyacrylamide gel and silver staining. Each primer pair amplified 2-22 variant alleles, with an average of 10.23. The polymorphism information content (PIC) values varied from 0.324 to 0.920, with an average of 0.779, and the genetic similarities were from 0.662 to 0.918. 84 hybrids were classified into five groups according to their genetic similarity by bounded coefficient of 0.745, and the group one could be subdivided into 4 sub-groups by bounded coefficient of 0.753 using UPMGA method, among which hybrids belonged to group one occupying 84.5 %. 【Conclusion】The results show that the genetic basis of Yunnan maize hybrids is relatively narrow, and there is homogeneity trend exist among hybrids.

Yunnan; Maize hybrids; SSR; Genetic diversity

1001-4829(2017)7-1488-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.004

2015-12-06

云南省技术创新人才培养项目(2011CI061)；云南农业大学百名人才培养项目(2012PY03)；云南农业大学博士启动基金项目(A2002276)

胡德分(1991-)，女，云南盐津人，硕士，主要从事玉米种质创新及利用研究，E-mail:18213589618@163.com。*为共同第一作者， E-mail: 1031742835@qq.com,**为通讯作者：赵自仙，E-mail:zhaozix@126.com，杨 久，E-mail: yaas2003@163.com。

S513

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