藏药翼首草抗类风湿性关节炎活性成分靶点的网络药理学研究Δ

唐 策，文 检，杨 娟，左 芳，孟宪丽，张 艺(成都中医药大学民族医药学院，成都 611137)

·民族医药·

藏药翼首草抗类风湿性关节炎活性成分靶点的网络药理学研究Δ

唐 策＊，文 检，杨 娟，左 芳，孟宪丽，张 艺#(成都中医药大学民族医药学院，成都 611137)

目的:探索藏药翼首草治疗类风湿性关节炎(RA)的多成分、多靶点、多途径作用机制。方法:将选取的目标化合物(即翼首草10个化学成分结构)采用相关软件进行数据的导入和存储，使用PharmMapper和DrugBank数据库进行靶点预测和筛选，通过MAS 3.0数据库对靶点进行通路获取并分析，最后使用Cytoscape 3.4.0软件构建翼首草“活性成分-靶点-通路”网络。结果:将PharmMapper数据库中获得的靶点信息与DrugBank数据库中与炎症相关药物的靶点进行比对，得到26个可能与翼首草治疗RA相关的潜在作用靶点，其中MAPK14、RXRA、ALB、PDE4D、VDR等靶点可能是翼首草活性成分治疗RA的主要潜在靶点基因群;26个作用靶点通过通路注释后得到57条作用通路，除27条与RA相关外，还涉及与内分泌调节、免疫相关的其他30条作用通路。结论:根据网络药理学研究结果认为，翼首草可通过作用于炎症、免疫、内分泌等相关的靶点及通路，发挥治疗RA的作用。

藏药翼首草;网络药理学;类风湿性关节炎;活性成分;靶点

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)在藏医学中称为“真布病”。藏医对“真布病”的临床治疗，以干黄水，调节培根、隆等紊乱为重要途径。藏医临床治疗“真布病”注重内外合治，从饮食起居开始调节，使用藏医独特复方药物配合藏药浴、推拿按摩、放血、火炙等特色外治手段，对“真布病”的治疗取得了独具特色的临床效果[1]。

翼首草(藏语名:榜姿多沃)[2]为川续断科翼首花属植物匙叶翼首花[Pterocephalushookeri(C.B.Clarke)Höe-ck]的干燥全草，是2015年版《中国药典》(一部)[3]收载的常见藏药，具有解毒除瘟、清热止痢、祛风通痹的功效。翼首草用药历史悠久，在藏医经典名著《四部医典》[4]和《晶珠本草》[5]中均有记载。本课题组前期对其进行的化学成分和药理作用研究表明，翼首草主要含有皂苷类和环烯醚萜类成分[6-10]，对佐剂炎症模型动物具有明显的改善作用。尽管目前对翼首草的药理研究已有较多的报道，但针对翼首草治疗RA的作用机制仍不清楚。因此，本文以网络药理学的方法对藏药翼首草化学成分抗RA的作用机制进行全面探讨，构建其“活性成分-靶点-通路”网络，阐释其治疗RA可能的分子作用机制，为后续实验研究提供一定的信息支撑，也为藏药的研究提供一种新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

UniProt数据库(http://www.uniprot.org/uniprot/); Cytoscape 3.4.0软件(http://www.cytoscape.org);Chem-BioOffice2014(美国PerkinElmer公司);PharmMapper数据库(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/);生物分子功能注释系统数据库(http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/，MAS 3.0);DrugBank数据库(http://www.drugbank.ca/);京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路数据库(http://www.genome.jp/kegg/)。

1.2 目标化合物的选取

在网络药理学研究过程中，以3个标准选取目标化合物:(1)翼首草中含有的化学成分;(2)翼首草中已经定量的化学成分;(3)翼首草中可入血的化学成分。笔者查阅文献[6，11-12]后，确定对翼首草中10个化合物(齐墩果酸、熊果酸、齐墩果酮酸、马钱苷、獐牙菜苷、绿原酸、林生续断苷Ⅰ、续断苷B、大花双参苷A、吴茱萸苷)进行研究。

1.3 化学成分结构数据的导入和存储

使用ChemBioOffice 2014软件绘制10个化学成分的结构，将其存为MDL sdf.格式。将建立的MDL sdf.格式文件导入ChemBio3D ultra软件，转换成3D形式，存储为mol2格式。

1.4 潜在作用靶点反向预测分析

将10个活性成分的3D-mol2格式文件导入Pharm-Mapper数据库进行潜在靶点的预测分析[13-14]，参数设置如下:Generate Conformers:Yes;Maximum Generated Conformations:100;Select Target Set:Human Protein TargetOnly;Number of Reserved Matched Targets:100。在检索过程中得到的潜在靶点有命名不规范或错误等问题。因此，需采用UniProt KB搜索功能得到其正确名称。经上述数据库检索和转化操作，获得与成分相关的蛋白或基因信息。

1.5 靶点的筛选

将预测得到的靶点信息与DrugBank数据库中美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的抗RA药物的靶点进行比对分析[15-16]，预测靶点中有明显抗RA作用的靶点，并统计频次[即某靶蛋白或靶基因在10个化学成分各100靶点(共计1 000个靶点)中出现的次数]，再对10个活性成分的靶基因和靶点数分别进行归纳，其中靶点数为去掉重复的靶基因后的数量。

1.6 相关通路获取及分析

将获取的靶点信息导入MAS 3.0中，得到靶点的相关通路信息后进行富集分析和通路注释分析[17]。参数设置如下:Species:Homo sapiens(Human);Molecule Type: Protein;Database Symbols:UniProt KB;Functions:Disease，Gene，mRNA，Protein，GO，Pathway;Regulation Threshold:Up 2.0，Down 0.5。需要注意的是，靶点仅使用MAS 3.0、KEGG中的数据。

1.7 翼首草“活性成分-靶点-通路”网络构建

以选取的10个化学成分、预测出的靶点和通路及通路注释为节点(node)，建立相互关系，导入Cytoscape 3.4.0软件，分析翼首草“活性成分-靶点-通路”的网络图[18]。在网络中，节点表示活性成分、靶点和通路。若某一靶点为某化合物的潜在作用靶点，则以边(edge)相连。

2 结果

2.1 翼首草化学成分的潜在靶点信息

将PharmMapper数据库中获得的靶点信息与Drug-Bank数据库中与炎症相关药物的靶点进行比对，得到26个可能与翼首草治疗RA的潜在作用相同的靶点，其中UniProt号、靶蛋白、靶基因和频次见表1。

表1 翼首草化学成分的潜在靶点信息Tab 1 Information of potential targets from componentsof P.hookeri

由表1可见，频次最高的靶点为有丝分裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)，其次为视黄酸受体RXR-α (RXRA)，其他如ALB、PDE4D、VDR等频次也较高，提示MAPK14、RXRA、ALB、PDE4D、VDR等是翼首草活性成分治疗RA的主要潜在靶点基因群。

在表1的基础上，对10个活性成分的靶基因和靶点数分别进行了归纳，结果见表2。

表2 翼首草化学成分的潜在靶基因、靶点数Tab 2 Potential target gene and target numbers from com ponentsof P.hookeri

齐墩果酸、熊果酸和齐墩果酮酸3个化合物的母核基本一致，均属于三萜类化合物，齐墩果酸和熊果酸还互为同分异构体。由表2可知，齐墩果酸作用靶点数为14个，熊果酸为10个，齐墩果酮酸为13个。这3个化合物相同的作用靶点有8个，其中齐墩果酸与熊果酸有9个相同的靶点，齐墩果酸与齐墩果酮酸有10个相同的靶点，而熊果酸与齐墩果酮酸有9个相同的靶点。在10个活性成分的作用靶点数中，续断苷B靶点数最多，为15个;马钱苷靶点数最少，为6个;其他活性成分的靶点数也不尽相同。可见翼首草不同化学成分不仅可作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，体现了其多成分、多靶点的抗RA作用机制。

2.2 翼首草化学成分潜在靶点的通路注释

将翼首草化学成分的26个作用靶点通过MAS 3.0及KEGG通路注释，得到57条作用通路，其中27条与RA相关。(1)直接与关节炎相关通路6条，包括Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、细胞因子受体相互作用、MAPK信号通路、黏着连接、嘌呤代谢。(2)与内分泌调节相关通路有18条，包括促性腺激素释放素信号通路、PPAR信号通路、胰岛素传导通路、脂肪细胞因子信号通路、甲状腺癌、神经活性配体-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调节、T细胞受体信号通路、JAK-STAT信号通路、细胞因子受体相互作用、钙离子信号通路、黏着连接、ErbB信号通路、细胞色素P450的异物代谢、MAPK信号通路、黏着斑、甘油酯代谢、视黄醇代谢。(3)与疼痛相关通路有6条，包括MAPK信号通路、钙离子信号通路、JAK-STAT信号通路、VEGF信号通路、Toll样受体信号通路、嘌呤代谢。(4)与炎症相关通路有9条，包括Toll样受体信号通路、细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路、甘油酯代谢、VEGF信号通路、花生四烯酸代谢、黏着斑、FcεRI信号通路。(5)与免疫相关通路有15条，包括自身免疫性甲状腺疾病、移植物抗宿主病、细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、T细胞受体信号通路、钙离子信号通路、神经活性的配体-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架的调节、Toll样受体信号通路、m TOR信号通路、胰岛素传导通路、MAPK信号通路、嘌呤代谢、甘油酯代谢、脂代谢。

2.3 翼首草“活性成分-靶点-通路”网络构建

采用Cytoscape 3.4.0软件构建翼首草化学成分-靶点-通路网络模型见图1。其中26个靶点中20个比对到代谢通路上(维生素D3受体、血清白蛋白、性激素结合球蛋白、核受体亚家族1组Ⅰ成员2、SEC14-like蛋白2和甲硫氨酸胺基肽酶2除外)。

图1 翼首草“活性成分-靶点-作用”通路网络图Fig 1 “Active com ponents-targets-pathways”network of P.hookeri

从图1中可发现，除“2.2”项下提到的那些靶点，目标化合物还涉及到其他30条通路，如非小细胞肺癌、丙酮酸代谢、亚油酸代谢、膀胱癌、子宫内膜癌、前列腺癌、小细胞肺癌、胰腺癌等。因此，翼首草抗RA的作用机制与炎症反应、免疫调节及内分泌激素等多种机制均有相关性，因此可从不同角度揭示翼首草抗RA的作用特点。

3 讨论

网络药理学的概念最早由英国药理学家Hopkins AL[19]于2007年首次提出，并于2008年进一步发表文章《网络药理学:药物研发中的下一个研究模式》[20]，打破了“一个靶标、一种药物”的传统理念，而“多靶点、多途径”的药物设计也被众多医药研究者所接受[21]。网络药理学本着整体性和动态性的特点，倡导多途径、多靶点的给药原则[20]。因此，在传统药物现代化进程中，可借鉴网络药理学的研究思路，探索药物的作用机制，揭示其多成分、多靶点、多途径的整体效应[22]。

白雨等[23]通过对同一药物进行研究以比较Pharm-Mapper、HTDocking和SEPID数据库预测结果的异同，结果发现PharmMapper数据库预测方法更适合用于分析药物的靶点信息。因此，本文采用PharmMapper数据库的网络药理学方法阐释翼首草“多成分、多靶点、多途径”的作用机制。

既往研究结果表明，RA形成过程中JAK-STAT、MAPK、VEGF信号通路均被激活，其中MAPK信号转导通路还包括了细胞外信号调节激酶(ERK)、p38、JNK 3条重要的与关节炎症相关的信号转导通路[24]。另外，VEGF是参与调控血管发生和血管发生的关键分子，几乎参与了RA发病的全过程。抗RA的药物通过调节MAPK和VEGF信号通路来抑制炎症细胞因子的产生和表达，来减少胶原蛋白的产生、抑制滑膜细胞增殖并减弱其侵袭能力，从而发挥抗RA的作用。

张明发等[25]发现，齐墩果酸和熊果酸可以抑制磷脂酶A2活性，阻滞花生四烯酸的产生，从而减少前列腺素和白三烯的生物合成，发挥抗炎的作用;徐英辉等[26]研究了绿原酸对佐剂性关节炎模型大鼠抗炎作用及其机制，发现绿原酸具有抗佐剂性关节炎的作用，并通过降低白细胞介素2水平发挥作用;Zhang L等[27]发现翼首草提取物具有抗炎镇痛的作用;Guo C等[28]发现翼首草提取物通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡，具有一定的抗肿瘤作用，还可抑制肝癌细胞生长。综合这些结果，可部分印证本研究的网络预测结果。

在对潜在作用靶点的通路注释中发现，翼首草中的化学成分都能作用于与免疫调节相关的通路，如MAPK、JAK-STAT、T细胞受体、钙离子等信号通路，所以推测翼首草可能会通过调节机体免疫发挥辅助治疗RA的作用。目前，关于这方面的研究还鲜有报道，仍需后续试验的进一步证明。

本文以翼首草中10个化学成分为研究对象，基于网络药理学的方法，采用KEGG、MAS 3.0、DrugBank、PharmMapper等数据库和Cytoscape 3.4.0软件，探索了翼首草治疗RA的靶点和机制;并通过网络的构建，发现预测的靶点和通路与文献报道的内容相吻合，再次证明了网络药理学预测的准确性，并初步揭示了翼首草治疗RA的调控网络，为下一步深入研究翼首草的作用机制奠定了基础，也为藏药的研究提供了新的思路和方法。

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Study on the Active Com ponents Targets of Tibetan M edicine Pterocephalus hookeri in Anti-rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology

TANG Ce，WEN Jian，YANG Juan，ZUO Fang，MENG Xianli，ZHANG Yi(College of Ethnic Medicine，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China)

OBJECTIVE:To explore the multi-component，multi-target，multi-channel mechanism of Tibetan medicine Pterocephalus hookeri in the treatment of rheumatoid arthritis(RA).METHODS:The selected target compounds(10 chemical structures of P.hookeri)were imported and stored by related software;target prediction and filtering were conducted by PharmMapper and DrugBank databases.The pathways of targetswere acquired and analyzed by MAS 3.0 database.Finally P.hookeri“active component-targeting-pathway”network was constructed by Cytoscape 3.4.0 software.RESULTS:The target information obtained in the PharmMapper database were compared w ith that of the DrugBank database for inflammation-related drugs，26 potential targets for the treatment of RA were obtained，in which MAPK14，RXRA，ALB，PDE4D，VDR may be themain potential target gene group in the treatment of RA.57 functional pathways were obtained after 26 functional targets were annotated by pathway.In addition to 27 RA-related pathways，30 other pathways such as endocrine regulation and immune were involved.CONCLUSIONS:Base on the study of network pharmacology，P.hookeri plays the role in the treatment of RA by acting on inflammation，immune，endocrine and related targets and pathways.

Tibetanmedicine Pterocephalus hookeri;Network pharmacology;Rheumatoid arthritis;Active components;Target

R285

A

1001-0408(2017)19-2666-05

2016-10-12

2016-12-07)

(编辑:刘 萍)

国家自然科学基金面上项目(No.81274193);四川省教育厅省属高校科研创新团队建设计划项目(No.11TD004)

＊博士研究生。研究方向:中药药效物质基础及质量标准化。电话:028-61800274。E-mail:409014182@qq.com

#通信作者:研究员，博士生导师。研究方向:民族药药效物质基础。电话:028-61800274。E-mail:9006zmy@sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.21