半枫荷快速繁殖技术及改进研究

林文革，毛新，林琛

（地缘（厦门）生物科技有限公司，福建厦门361006）

半枫荷快速繁殖技术及改进研究

林文革，毛新，林琛

（地缘（厦门）生物科技有限公司，福建厦门361006）

本研究提供了一种新的半枫荷快速繁殖体系，以优良种源的半枫荷的茎段为外植体，诱导丛生芽增殖、生根、组培苗驯化移栽而建立起半枫荷完整的快速繁殖体系。目的是提供一种简单、诱导率高、成活率高的半枫荷的完整组培快繁方法。并且进一步通过组培组分的优化，使增殖率达到理想程度的3～4倍，生根率稳定在95%以上，移栽成活率达到95%以上。利用此方法可以简单、高效地培育出大量的半枫荷组培苗，从而有效地保护和繁殖该物种，满足市场对半枫荷的需求，同时解除半枫荷的濒危状态，为今后更进一步保护和利用该物种奠定良好的基础。

半枫荷；组织培养；快速繁殖；濒危植物

半枫荷(Semiliquidambar cathayensis)为金缕梅科半枫荷属植物，为1962年发表的新属半枫荷属模式种，我国特有种[1]。该物种在学术研究、中医药用以及园林应用等很多方面都具有极高的价值。但是人为的不合理开发利用，导致其资源被破坏严重。半枫荷在1987年国家环境保护局等颁布的《中国珍稀濒危保护植物名录（第一册）》中，被列为国家三级重点级保护植物；在1992年傅立国主编的《中国植物红皮书—稀有濒危植物》中被列为稀有种；在国务院1999年8月4日颁布的《国家重点保护野生植物名录（第一批）》中被提升为国家II级保护植物。在2003年，汪松、解焱主编的《中国物种红色名录》中有关专家根据数据资料推测，半枫荷在过去3个世代内致危因素没有停止，种群至少减少了30%，因此将半枫荷列入易危等级，在未来一段时间内其种群面临绝灭的概率较高。

半枫荷是一种珍贵的药用植物，根、枝、树皮都可入药，能活血通络、祛风除湿，可以治疗风湿性关节炎、腰肌劳损、半身不遂、跌打淤积、肿痛、产后风瘫，外伤常用于止血，是产区群众常用的中药，具有很高的药用价值[2-4]。目前，半枫荷作为重要的中药已得到了广泛的重视和开发。如半枫荷散、中药巴布剂、半枫荷类注射液、苗岭骨力胶囊等[5,6]。

由于半枫荷对生态环境的要求比较苛刻，其自然繁殖率较低，加上人们长期的过量采挖，野生资源已经极度枯竭。面对这样严峻的形势，对半枫荷的人工繁殖问题的研究是极为重要的。植物组织无菌培养方法是寻求解决半枫荷资源枯竭、保护其优良品种的有效途径。近年来，人们对半枫荷的药用成分及价值的研究日益增多[7-9]，目前对半枫荷进行完整过程的组培育苗研究还未见报道，组培无菌培养快速繁殖方面多以茎段和叶片为外植体诱导。

植物的组织培养指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。不同植物在离体培养过程中对基本培养基类型、激素配比、培养条件等要求不同。目前利用植物组织培养技术在开展植物种质资源保护和生产经济苗木等方面技术已日趋完善。现有技术大部分是以半枫荷叶片为外植体诱导愈伤，通过愈伤组织增殖，在诱导愈伤组织分化成芽，且未诱导出不定根。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料取自福建三明沙县、福建漳州南靖、江西赣州新余、江西赣州全南县4个不同种源的半枫荷。

1.2 培养条件

芽诱导培养基成分：改良MS培养基、6-BA 1.5～2.5 mg/L、NAA 0.2～0.4 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉胶6.7 g/L，pH值5.8～6.0；芽增殖培养基成分：改良MS培养基、6-BA 0.4～0.8 mg/L、NAA 0.05～0.15 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉胶6.7 g/L，pH值5.8～6.0；生根培养基成分：改良MS培养基、IBA 0.4～0.8 mg/L、NAA 0.1～0.3 mg/L、蔗糖30 g/L、卡拉胶6.7 g/L，pH值5.8～6.0；MS培养基、改良MS培养基、1/2改良MS培养基组成如表1、2、3所示。

1.3 实验方法

1.3.1 半枫荷优良种源确定

分别检测取自福建三明沙县、福建漳州南靖、江西赣州新余、江西赣州全南县4个不同种源的半枫荷的齐墩果酸含量，获得优良种源——江西赣州全南县半枫荷和福建三明沙县半枫荷，以此优良种源开展后续的组培研究，见图1。

1.3.2 无菌材料的建立

取半枫荷的当年生枝条为外植体。在合适时间，一般最优时间为连续晴天7 d后于12：00 AM～2∶00 PM取材，并将此优良母株当年生枝条为外植体。对外植体进行消毒处理获得无菌材料，首先将其用洗洁精清洗并浸泡10 min，再用流动水冲洗30 min后，置于无菌操作台上，剪成带有1～2个节间的茎段。将茎段用75%的乙醇处理25 s，再用0.1%升汞溶液浸泡处理10 min，期间不断震荡，最后用无菌水彻底清洗6遍，备用。

表1 MS组分

表2 改良MS组分

1.3.3 芽诱导培养

将无菌材料接种于芽诱导培养基上，在温度为25～27℃、光照强度为3 000～5 000 lx、光照时间为8～12 h/d的条件下，诱导培养出不定芽观察并记录芽的长势，14 d后测量腋芽的高度，计算芽的诱导率。观察记录完成后，进行下一步实验操作。

表3 1/2改良MS组分

图1 半枫荷优良母株

1.3.4 半枫荷组织培养的芽增殖与生根

将诱导培养出的不定芽转接至芽增殖培养基中，在温度为25～27℃、光照强度为3 000～5 000 lx、光照时间为8～12 h/d的条件下，观察记录新芽的生长情况，统计其增殖系数。将生长状况良好、长度为2～3 cm的不定芽转接至生根培养基中，温度为25～27℃、光照强度为3 000～5 000 lx、光照时间为8～12 h/d。观察并记录生根时间、根的长度，计算生根率。

1.3.5 移栽大田

将生根瓶苗转至移栽大棚进行炼苗。7 d后将其从瓶中小心取出，洗净根部培养基后，用0.1%代森锰锌浸泡处理2～3 min后，在阴凉处干燥，待植株枝干上的水分阴干的差不多时，移栽入事先已用0.1%高锰酸钾消毒的基质（泥炭土∶草炭∶珍珠岩为9∶6∶1）中。移栽后做好田间湿度管理，最后观察记录并计算成活率。

1.3.6 优化组培配方

在以茎段为外植体的组培快繁过程中，改良MS培养基中的大量元素NH4NO3、KNO3的浓度，具体变化见表2、表3。并且在芽诱导培养基、芽增殖培养基和生根培养基中调整激素浓度，添加稀土元素，增加Vc控制褐化，达到理想的增殖率、生根率。

1.3.7 计算方法

诱导率（%）=外植体起动个数/接种外植体总数× 100%；

增殖系数=现有不定芽数/接种不定芽数×100%；

生根率（%）=生根苗数/接种苗数×100%；

成活率（%）=（成活株数／接种株数）×100%。

2 结果与分析

2.1 半枫荷不定芽的诱导培养

将无菌材料接种于芽诱导培养基上，在合适的温度、光照强度、光照时间条件下，培养14 d后诱导出了2～3 cm的不定芽，经过计算得到诱导率为70%。

2.2 芽增殖与生根

将生长良好的愈伤组织转接入增殖培养基中，进行增殖培养。约7 d后可见不定芽与培养基接触的地方冒出新的芽点，28 d后统计其增殖系数为5.62%，叶片颜色正常，瓶苗生长状况良好，如图2和图3所示。将不定芽转接至生根培养基中，5 d后可见其茎段末端切口处冒出白色根原基，继续培养14 d后长成2～3 cm的根，如图4所示。计算得到此时的生根率达到98.7%。

2.3 生根瓶苗移栽大田研究

将生根瓶苗转至移栽大棚，如图2所示进行穴盘移栽，在合适的温度、湿度等条件的控制下，最终移栽成活率达到94.2%，得到半枫荷移栽苗木，见图3。

2.4 组织培养优化

以当年生半枫荷茎段为外植体，通过调整培养基成分中的大量元素和激素浓度，添加稀土元素，增加Vc控制褐化，最终达到理想的增殖率3～4倍，生根率稳定在95%以上，移栽成活率达到95%以上。

3 讨论与结论

图2 半枫荷穴盘移栽

图3 半枫荷移栽苗木

图4 半枫荷不定芽生根结果

利用优良种源的当年生半枫荷的茎段作为外植体，能直接诱导出芽，芽再增殖生根，这是木本植物快繁的主要途径，生物学特性比较稳定[9,10]。而本研究在茎段为外植体，直接诱导不定丛生芽，避免了现有技术中用愈伤分化丛生芽易出现变异的情况，再通过不定丛生芽的增殖、生根培养、组培苗的驯化移栽、组培成分优化，最后建立起半枫荷完整的快速繁殖体系，并能够很好地保持原品种特征。并且通过改变MS培养基中的大量元素NH4NO3、KNO3的浓度，在培养基中调整激素浓度，添加稀土元素，增加Vc控制褐化，达到理想的增殖率，生根率。

本研究的诱导率是用茎段诱导不定芽的诱导率，全南县来源的半枫荷的诱导率可以达到70%的水平，并且通过不定从芽的增殖，其增殖系数高达5.62，并且生根率和移栽成活率均较高，分别达到了98.7%和94.2%。对于沙县来源的半枫荷进行了相同的操作流程，组培成分改进优化后，其增殖系数超过预期目标的3～4倍，生根率和移栽成活率均超过了95%。因此，利用此方法可以简单的、高效的培育出大量的半枫荷组培苗，从而有效地保护和繁殖该物种。

同时，本研究是依据供试材料取自福建三明沙县、福建漳州南靖、江西赣州新余、江西赣州全南县4个不同种源的半枫荷。重点对于江西赣州全南县以及福建三明沙县来源的半枫荷进行试验观测，实验结果均表现出优秀的增殖系数、生根率以及成活率，具一定的普适性，对生产有更强的指导意义。

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