罗红霉素对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环的舒张作用

2017-08-09 01:38于孟飞王倩刘松青沈金花刘庆华中南民族大学生命科学学院武汉430074
山东医药 2017年26期
关键词:罗红霉素离子通道肌张力

于孟飞,王倩,刘松青,沈金花,刘庆华(中南民族大学生命科学学院,武汉430074)



罗红霉素对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环的舒张作用

于孟飞,王倩,刘松青,沈金花,刘庆华
(中南民族大学生命科学学院,武汉430074)

目的 观察罗红霉素对小鼠气管环的舒张作用,并探讨其作用机制。方法 取BALB/c小鼠15只,处死后分离气管环,将气管环置于灌流槽中,经过高钙液平衡后开始实验。使用激动剂乙酰胆碱(Ach)100 μmol/L收缩气管环,待气管环张力达到平台期后,分别加入终浓度为10-2、10-1.5、10-1、10-0.5、100、100.5、100.75、101mg/mL的罗红霉素,观察不同浓度罗红霉素作用下的气管环肌张力和舒张比率,将引起气管环最大舒张的最低药物浓度100.75mg/mL作为罗红霉素最佳药物浓度。向灌流槽中加入100 μmol/L Ach预收缩气管环,随后加入L型钙离子通道抑制剂硝苯地平、非选择性阳离子通道抑制剂吡唑盐3(Pyr3),待抑制剂舒张气管作用达到平台期后,加入100.75mg/mL罗红霉素,观察气管环的肌张力变化和舒张比率。结果 Ach预收缩的气管环的肌张力为(7.03±0.35)mN,加入最佳浓度的罗红霉素后,肌张力降至(3.47±0.29)mN(P<0.05)。加入硝苯地平、Pyr3后气管环的肌张力降低,舒张比率增加(P均<0.05);继续加入罗红霉素后,气管环的肌张力继续降低,舒张比率较前升高(P均<0.05)。结论 罗红霉素对小鼠Ach预收缩的气管环具有舒张作用,并可增强硝苯地平、Pyr3对于Ach预收缩气管环的舒张作用,其主要通过调控钙离子通道来发挥作用。

气管环;乙酰胆碱;罗红霉素;钙离子通道;气管舒张;哮喘

哮喘是由嗜酸粒细胞、淋巴细胞等多种炎性细胞参与的慢性气道炎症,其发病机制与以支气管平滑肌收缩为主的过敏反应有关,其气道阻塞是可逆的[1]。哮喘发作时,乙酰胆碱能神经兴奋可引起乙酰胆碱(Ach)大量释放,并导致气管平滑肌细胞膜上的钙离子通道(主要是L型钙离子通道和非选择性阳离子通道)的开放,引起Ca2+内流、气管收缩和气管腔缩窄,造成呼吸困难。研究显示,L型钙离子通道特异性抑制剂硝苯地平可以有效缓解哮喘患者的症状[2],非选择性阳离子通道抑制剂Pyr3对气管环也具有舒张作用,对哮喘具有一定的治疗效果[3]。罗红霉素作为一种抗炎药物,常用于单独或联合其他药物(如沙丁胺醇)治疗哮喘[4~10],来缓解咳嗽等相关症状。近期研究发现,苦物质对气管具有强烈的舒张作用,具有开发成为治疗药物的潜力[11]。罗红霉素作为一种苦物质,除了具有消炎作用之外,是否可以对气管发挥舒张作用,从而实现对哮喘的治疗尚无定论。2016年2~6月,我们以Ach作为气管环收缩的激动剂,观察罗红霉素对气管环的舒张作用,并观察罗红霉素对L型钙离子通道抑制剂硝苯地平、非选择性阳离子通道抑制剂吡唑盐3(Pyr3)舒张气管作用的影响,探讨罗红霉素治疗哮喘的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 8~10周龄SPF级BALB/c小鼠,购于湖北省实验动物中心。自由饮水、进食,每周更换垫料。罗红霉素分散片(江苏黄河药业),氯化钠、氯化钾、六水氯化镁、盐酸、氢氧化钠、葡萄糖等购于国药集团化学试剂有限公司。无水氯化钙购于天津科密欧化学试剂有限公司。HEPES、Ach、硝苯地平、Pyr3、二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司。高钙液(PSS)的配制:135 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,1 mmol/L MgCl2,2 mmol/L CaCl2,10 mmol/L HEPES,10 mmol/L葡萄糖注射液(pH=7.4)。硝苯地平、Pyr3溶于DMSO制成100×母液,-80 ℃保存备用。将罗红霉素分散片碾碎并溶解于PSS中,制成56.2 mg/mL的罗红霉素母液。

1.2 气管环的制备 静脉注射戊巴比妥钠150 mg/kg处死小鼠,剪下气管,去除附着组织,剪成3~4 mm长的气管环。将气管环套入张力换能器的三角形挂钩中,挂钩上端连接张力换能器,下端固定于氧气出口上方的挂钩上,浸泡于通氧的37 ℃的PSS灌流槽中。将气管环前负荷设置为0.3 g。每15 min更换PSS一次,共换液4次,完成预平衡。用100 μmol/L Ach对气管环进行预刺激,待张力达到平台期后,以PSS洗脱Ach,等气管环张力达到基线,完成1次预刺激。预刺激3次后开始正式实验。

1.3 罗红霉素最佳药物浓度的确定 向灌流槽中加入不同体积的罗红霉素母液,使灌流槽中的罗红霉素浓度依次达到10-2、10-1.5、10-1、10-0.5、100、100.5、100.75、101mg/mL,在药物作用达到平台期时,读取张力换能器显示的张力数值。实验结束后,将气管环置于56 ℃烘箱中烘干12 h,然后称取干重(mg)。气管环的瞬间肌张力(mN)=(瞬间张力值-300)mg/气管环干重(mg)。罗红霉素对气管环的舒张比率=(未加罗红霉素时平台期肌张力-添加某一浓度罗红霉素后平台期肌张力)/未加药物时肌张力×100%。比较不同浓度罗红霉素对气管环的舒张比率,将引起气管环最大舒张的最低药物浓度100.75mg/mL作为罗红霉素的最佳浓度。

1.4 罗红霉素对硝苯地平舒张气管环作用影响的观察 气管环经平衡和预刺激后,向灌流槽中加入100 μmol/L Ach,刺激气管环使其收缩达到最大值,并进入平台期,读取张力换能器显示的肌张力数值。然后加入10 μmol/L硝苯地平舒张气管环。待舒张作用达到稳定后,读取肌张力数值。最后,加入100.75mg/mL罗红霉素,读取肌张力数值。

1.5 罗红霉素对Pyr3舒张气管环作用影响的观察 气管环经平衡和预刺激后,向灌流槽中加入100 μmol/L Ach,刺激气管环使其收缩达到最大值,并进入平台期,读取肌张力数值。然后,加入30 μmol/L Pyr3舒张气管环,待舒张作用达到稳定后,读取肌张力数值。最后,加入100.75mg/mL罗红霉素,读取肌张力数值。

2 结果

2.1 罗红霉素对Ach预收缩气管环的舒张作用 不同浓度罗红霉素对Ach预收缩的气管环肌张力、舒张比率的影响见表1。100.75mg/mL罗红霉素作用后的气管环舒张比率最高,为最佳药物浓度。见表1。

2.2 罗红霉素对硝苯地平舒张气管环作用的影响 加入硝苯地平前,气管环的肌张力为(8.61±0.42)mN,舒张比率为0;加入硝苯地平后,肌张力降至(7.31±0.34)mN,舒张比率增加至15.1%±4.9%(P均<0.05);继续加入罗红霉素后,肌张力降至(5.22±0.51)mN,舒张比率增加至39.4%±5.9%(P均<0.05)。

表1 不同浓度罗红霉素对Ach预收缩的气管环的舒张作用

2.3 罗红霉素对Pyr3舒张气管环作用的影响 加入Pyr3前,气管环的肌张力为(7.63±0.72)mN,舒张比率为0;加入Pyr3后,肌张力降至(5.40±0.71)mN,舒张比率增加至29.2%±9.3%(P均<0.05);继续加入罗红霉素后,肌张力降至(3.54±0.53)mN,舒张比率增加至53.6%±6.9%(P均<0.05)。

3 讨论

哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症,常伴随气道反应性增高、气道平滑肌收缩力增强,导致反复发作的喘息、气促、胸闷和(或)咳嗽等症状,此类症状常伴有广泛而多变的气流阻塞,能够自行或通过药物干预治疗而逆转。糖皮质激素是目前治疗哮喘应用最广泛的药物,但长期服用可引起肌肉无力、消化性溃疡、水钠潴留、高脂血症等不良反应,导致其临床应用受限。因此,寻找和开发治疗哮喘的新药从而进一步缓解哮喘,成为重要的研究课题。

哮喘发作时,主要是胆碱能神经兴奋,促使Ach大量释放。随后Ach通过与平滑肌细胞膜上的特异性受体结合,激活L型钙离子通道和细胞膜上的G蛋白;然后激活下游的磷脂酶C、三磷酸肌醇和二酰甘油,引起肌细胞内Ca2+浓度升高;最后激活肌球蛋白轻链蛋白的磷酸化,从而触发肌细胞收缩。硝苯地平作为L型钙离子通道阻断剂,可以有效阻止气管平滑肌细胞Ca2+通道开放,导致Ca2+内流减少、气管舒张。Ach在引起气管环收缩的过程中,可以同时激活L型钙离子通道和非选择性阳离子通道[13]。因此,L型钙离子通道抑制剂硝苯地平、非选择性阳离子通道抑制剂Pyr3可被用来缓解哮喘症状。然而,这两种药物在临床治疗哮喘过程中仍存在一些问题亟待进一步阐明。其治疗哮喘的分子作用机制仍有待深入研究。

近期研究发现,苦物质具有舒张气管的作用。罗红霉素作为一种苦物质,是否可以通过舒张气管从而治疗哮喘尚不明确。此外,罗红霉素是十四元环大环内酯类抗生素,是红霉素的衍生物,可以通过纠正Th1/Th2细胞因子失衡,发挥抑制炎症作用,临床常用其治疗敏感菌、支原体、衣原体等感染后引起的呼吸道感染和哮喘等疾病[5,6]。但单纯抗炎治疗并不能根治哮喘,不能完全消除部分哮喘患者的气道高反应性,即气管平滑肌收缩力增强和敏感性升高的现象。鉴于罗红霉素已被临床证明具有安全、高效和廉价等优点,因此罗红霉素具备作为解痉剂来治疗哮喘的潜力。本研究结果显示,在硝苯地平或者Pyr3存在的条件下,罗红霉素能够将气管环的肌张力由(7.31±0.34)mN和(5.40±0.71)mN分别降低至(5.22±0.51)mN和(3.54±0.53)mN,舒张比率分别达到39.4%±5.9%和53.6%±6.9%。表明硝苯地平与罗红霉素联合作用可以使Ach预收缩气管环发生部分舒张,Pyr3与罗红霉素联合作用也可以使Ach预收缩的气管环发生部分舒张,推测罗红霉素可通过增强L型钙离子通道抑制剂、非选择性阳离子通道抑制剂,发挥促进Ach预收缩的气管环舒张的作用,提示罗红霉素与硝苯地平或Pyr3联用可以更好地控制哮喘[12]。

综上所述,罗红霉素可以增强L型钙离子通道抑制剂硝苯地平及非选择性阳离子通道抑制剂Pyr3对Ach预收缩气管环的舒张作用,其机制可能与抑制L型钙离子通道和非选择性阳离子通道有关。

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国家自然科学基金面上项目(31571200)。

刘庆华(E-mail: 2011093@mail.scuec.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.011

Q253; Q28

A

1002-266X(2017)26-0038-03

2017-01-22)

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