茄子烂秆病的病原鉴定

杨绍丽++吴仁锋

摘要：从湖南省寄来茄子病样中分离出引起茄子烂秆病的病原真菌，对该菌进行了形态学观察、致病性测定及分子鉴定。结果表明，病原菌形态学鉴定为拟茎点霉（Phomopsis vexans）。对菌株HNQJ的核糖体RNA基因内转录间隔区（rDNA-ITS）进行PCR扩增和序列测定，并在GenBank中进行比对分析，根据rDNA-ITS序列分析结果结合病株症状和病菌的形态学特征，认为湖南茄子烂秆病的病原菌为拟茎点霉。

关键词：茄子烂秆；形态学；分子鉴定；rDNA-ITS分析

中图分类号：S436.411 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）13-2455-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.014

Identification of Pathogen Causing Eggplant Rotten Stem

YANG Shao-li， WU Ren-feng

（Institute of Vegetable， Wuhan Academy of Agricultural Science and Technology， Wuhan 430065， China）

Abstract： A pathogen causing eggplant rotten stem was isolated from disease samples selected in Hunan province， then the morphological observation， pathogenicity test and molecular identification were carried out. The result showed that the pathogen of Eggplant rotten stem was identified as Phomopsis vexans by morphology. The rDNA-ITS genes of isolate HNAJ were amplified and sequenced， then the results were compared and analyzed in GenBank. According to the sequence analysis， combining the symptom of diseased plants and the morphological characters of pathogen， the pathogen causing eggplant rotten stem of Hunan was identified as Phomopsis vexans.

Key words： eggplant rotten stem； morphology； molecular identification； rDNA-ITS analysis

湖南省瀏阳市茄子产区发生毁灭性烂秆病，从2010年的小面积发病到2011年、2012年连续两年大面积暴发，严重的区域甚至出现绝收，给农户造成极大的损失。该病从发现中心病株到全田枯死要2个多月，严重的到8月底至9月初时基本绝收。本研究收集并分离茄子烂秆病病样，进行病原菌分离、致病性测定和病原形态学和分子鉴定，以明确湖南地区茄子烂秆病的病原，为病害诊断和防治提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 病样来源

2011年和2012年从湖南省浏阳市寄来的茄子烂秆病病样。

1.2 病原菌的分离

病原菌的组织分离[1]：取典型带病茎秆，75%乙醇消毒，无菌水冲洗晾干，无菌刀片切取病健交界处小块组织，用0.1%升汞溶液表面消毒3～5 min，无菌水冲洗3次，吸干组织块表面水分，再将可能被杀死的组织剪去，接入PDA培养基，每皿3～5块，置25 ℃恒温箱中培养观察。菌丝萌发后，选典型菌落转接3次，5 d后用直径6 mm的打孔器，从菌落边缘打取菌饼，转接与PDA平板纯化培养。

1.3 致病性测定

用分离获得的病原菌菌饼，进行盆栽健康无病茄子茎秆有伤（针刺）和无伤接种试验。选取健康无病的茄子植株，用培养7 d的菌饼贴在伤口处和无伤接种处，用浸湿的棉球保湿，保鲜膜包裹住棉球及菌饼。以无菌培养基饼做对照，3 d后取下棉球及菌饼，观察记录发病情况。待发病后，用上述“1.2”中的方法分离培养，并与接种物比较，确定是否为同一病原物。

1.4 病原菌培养性状、形态观察

1.4.1 直接镜检 从典型症状的病茎上挑取病原的分生孢子器，制作临时玻片，进行分生孢子器、分生孢子的形态观察，初步确定病原菌的种类，可与组织分离培养物进行相互验证。

1.4.2 病原物培养观察 通过柯赫氏法则验证，确定茄子烂秆病的病原。将供试菌株接种到PDA平板上，25 ℃培养箱培养，测量菌落生长直径，描述菌落颜色、形态，挑取培养物，用显微镜观察分生孢子器、分生孢子形态，测量其大小。

1.5 病菌核糖体RNA基因内转录间隔区（rDNA-ITS）序列比较

1.5.1 菌丝体的培养与收集 选取典型菌株HNQJ进行分子检测。将斜面保存的菌株接种在PDA培养基上进行活化。将活化后的菌株移接在铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上（每皿约30 mL培养基），每皿均匀接种2个菌丝块，每菌株接2～3个平板。于25 ℃培养7 d后，用灭菌解剖刀刮取菌丝，置于4 ℃保存备用。

1.5.2 基因组DNA的提取 基因组DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltriethylammonium bromide，CTAB）法提取和纯化[2]。

1.5.3 ITS扩增 用真核生物核糖体DNA通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增[2]。其序列为，TS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.5.4 PCR反应条件 PCR反应体系总体积为50 μL，反应液组分为：10×PCR Buffer 5 μL，25 mM MgCl2 4 μL，10 mM dNTP 2 μL，5 U/μL Taq酶 0.3 μL，模板DNA 10 ng，引物ITS1和ITS4（25 μmol/L）各1 μL，用ddH2O使总体积达到50 μL，在PTC-100 PCR扩增仪上扩增。扩增条件：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min；54 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物委托武汉擎科创新生物科技有限公司进行纯化和测序。

1.5.5 ITS序列分析 将测序所得菌株的核糖体DNA-ITS序列与互联网GenBank中核酸数据库中的ITS区相关序列进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 病样采集和病原分离

2011年和2012年6月湖南省浏阳地区茄子茎秆腐烂病的发生危害严重，连续两年邮寄烂秆病样标本，并对8份样品进行分离，均能分离出Phomopsis属真菌且形态一致。以2012年分离菌株HNQJ为模式菌株进行鉴定，本研究中涉及到病原菌的所有试验，使用的均为该菌株。

2.2 致病性测定

经侵染回接试验，有伤接种和无伤接种茄子茎秆均可发病，发病率分别为100%和70%。有伤接种的病情严重，发展较快，易倒伏，无伤接种潜伏期长，病状出现相对较晚，但后期同样枯死，对照均未发病（图1）。接种发病症状与自然发病症状基本一致。发病茎秆进行再分离，仍得到相同结果。

2.3 病原菌形态学鉴定

2.3.1 直接镜检 载孢体在植物组织上，初期埋生，后突破表皮，能够看到球形黑色小点。镜检分生孢子器球型，扁球形，有孔口，直径120～210 μm。可观察到两种类型的分生孢子，一种是椭圆形或纺锤形（α型-分生孢子），通常内含2～3个油球；另一种呈细长线状，并在一端弯曲成钩（β型-分生孢子），β型-分生孢子不能萌发（图2）。

2.3.2 培养形态 在PDA培养基上菌落呈轮纹状辐射生长，菌丝米黄色，菌落上有白色菌丝簇（图3A），不产生分生孢子器，5 d直径83 mm（PDA，25 ℃）。光照条件下培养10 d后，培养基背面有黑色油滴状分生孢子堆产生（图3B），挑取黑色分生孢子器，载玻片上压碎，镜检可以观察到凸透镜型有孔口的分生孢子器（图3C），压破分生孢子器有无数β型分生孢子从分生孢子器孔口溢出。与直接镜检不同的是培养条件下仅能观察到β型分生孢子（图3D）。

2.3.3 形态鉴定依据 对该菌在培养基上进行培养形态、分生孢子器、分生孢子、产孢细胞进行描述，比对《真菌鉴定手册》、《中国真菌志：拟茎点霉属》以及魏景超[3]、戚佩坤等[4]、周永力等[5]对Phomopsis属各个种的描述，初步确定引起湖南地区茄子烂秆病的病原为拟茎点霉（Phomopsis vexans）。

2.4 rDNA-ITS序列分析

菌株HNQJ的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得一条550 bp左右的扩增条带。将PCR产物送武汉擎科创新生物科技有限公司进行序列测序。将测定的序列与GenBank中已有的拟茎点霉（登录号为KJ002759.1）的序列进行比对，结果表明，HNQJ与其序列相似性最高，达99.0%；因此，可证实病原真菌分离物HNQJ为拟茎点霉属真菌，与形态学鉴定结果一致。

3 小结与讨论

研究表明，引起湖南地区茄子烂秆病的病原为半知菌亚门拟茎点霉属真菌Phomopsis vexans。该病菌不仅可以从伤口侵入，也可以直接从表皮侵染，并且伤口有利于病原菌侵入并加重病害发生，主要为害茄子茎秆，引起茄子茎秆腐烂，植株枯死。自然条件下分生孢子有两种类型，一种是椭圆形或纺锤形（α型），另一种呈细长线状，并在一端弯曲成钩（β型），而在人工培养条件下仅能观察到β型。吴仁锋等[6]研究发现武汉地区分离茄子褐纹病菌病原分生孢子主要为α型分生孢子，目前自然条件及人工培养条件下还未发现β型分生孢子。说明地理的差异，对分生孢子形态的产生有较大影响，为此，对不同来源的菌株进行形态、致病性、生物学特性等还有待深入研究。

在形态学鉴定的基础上，通过对病原菌rDNA-ITS区扩增所得序列与GeneBank中的序列进行同源性比较。结果表明，菌株HNQJ与Phomopsis vexans的同源性最高，这也验证了形态学的鉴定结果。在真菌鉴定上应以形态学鉴定为基础，分子鉴定为补充，rDNA-ITS序列分析结果可作为形态学鉴定的辅助验证[7]。

参考文献：

[1] 方中达.植病研究方法[M].第三版.北京：中国农业出版社，1998.

[2] GRAHAM G C，MAYSER P，HENRY R J. A simplified method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD analysis[J]. Biotechniques，1994，16（1）：48-50.

[3] 魏景超.真菌鑒定手册[M].上海：上海科学出版社，1979.

[4] 戚佩坤，姜子德，向梅梅.中国真菌志 第三十四卷 拟茎点霉属[M].北京：科学出版社，2007.

[5] 周永力，吕国忠，刘伟成，等.球壳孢目真菌个体发育研究Ⅰ：壳二孢等四属[J].菌物系统，1998，17（3）：199-205.

[6] 吴仁锋，杨绍丽，杨德枝.茄子褐纹病病原鉴定及其生物学特性研究[J].中国蔬菜，2013（8）：80-85.

[7] 孙广宇，彭友良，李振歧，等.核苷酸序列分析在真菌系统学研究中的应用[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2003，31（6）：187-192.