忧遁草的抗氧化作用研究

彭亚博　林其洋　魏钊异

摘 要：忧遁草（Clinacanthus nutans CN）是东南亚地区著名的中草药植物，含有多种植物化学成分，常被使用于治疗炎症与癌症。该研究通过测定还原力、ABTS自由基、DPPH自由基以及羟自由基的清除能力，对忧遁草的抗氧化性进行了全面评估，通过不同产地的忧遁草提取物和torlox的对比得到了海南忧遁草对DPPH自由基、ABTS自由基、以及羟自由基的IC50分别为0.895mg/mL、0.494mg/mL和0.932mg/mL，产自揭阳忧遁草IC50为0.685mg/mL、0.262mg/mL、0.801mg/mL。可见，忧遁草具有较好的抗氧化作用，且产自揭阳的忧遁草提取物的抗氧化能力优于产自海南的忧遁草提取物。

关键字：忧遁草；抗氧化；研究进展

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）14-0025-05

Abstract：The antioxidant potentials of the methanol extracts from CN were measured as 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and 2，2'-azinobis- （3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid） （ABTS） radical scavenging abilities as well as the reducing power assay.IC50 of CN extract from Hainan Province were respectively 0.895mg/mL（DPPH），0.494mg/mL（ABTS） and 0.932mg/mL（OH-），while these values of CN extract from Jieyang were 0.685mg/mL（DPPH）and 0.262mg/mL （ABTS），0.801mg/mL（OH-）.The result illustrated that the antioxidant activities of CN extract from Jieyang was stronger than that of Hainan.It suggested that CN extract could be considered as natural antioxidant sources and dietary nutritional supplements to prevent oxidation-related diseases.

Key words：Clinacanthus nutans；Antioxidant activity；Research progress

憂遁草为爵床科（Acanthaceae）鳄嘴花属鳄嘴花Clinacanthus nutans的全草，早期归类于扭序花属，其别名有鳄嘴花、扭序花、青箭、沙巴蛇草、柔刺草等，广泛分布于马来西亚、泰国、印度尼西亚以及我国南部至西南部如海南、广东、广西、云南等地区。在东南亚国家，尤其是泰国和马来西亚，忧遁草是当地一种比较著名且广泛使用的药用植物，我国《广西药用植物名录》最早记录了该种药用植物该植物繁殖一般利用茎切为主要繁殖方式[1-3]。近年来，忧遁草引起了全世界科研人员的目光，源于一名马来西亚淋巴癌患者服用忧遁草而痊愈的事件，受到了许多患者的亲睐，目前，国内销售的忧遁草主要来源于海南五指山地区和广东揭阳地区。

通过许多研究者的努力，忧遁草中的主要成分已经被逐渐探明，忧遁草内含有多种不同类型的化合物，主要包括三萜类、黄酮碳苷类、叶绿素类，含硫糖苷类以及植物甾醇类以及一些小分子化合物和生物碱。有学者在20世纪70年代发现了忧遁草中含有三萜类化合物如羽扇豆醇、白桦脂醇[4，5]，其后，有学者从忧遁草中又发现了诸如（clinacoside A、clinacoside B、clinacoside C）的含硫糖苷类物质[6]。Teshima KI等[7]研究结果发现了忧遁草中含有某些黄酮碳苷类如牡荆草素等，徐淑芬[8]与Tu SF等[9]从忧遁草中分离纯化获得了一些含硫化合物。Ayudhya TDN[10]和SakdaratS等[11]在研究中分别分离纯化得到了3种和8种叶绿素，Ayudhya TDN分离纯化得到的是3种脱镁叶绿素，而SakdaratS则得到8种叶绿素，其中有5种结构没有被探明，但有3种结构与叶绿素和叶绿素类似。忧遁草中还富含钙、铁、镁等微量元素以及多种氨基酸和其他化合物。此外还含大量人体必需氨基酸、脂肪酸、矿物质[12]。Yong YK[13]采用在分析忧遁草的抗肿瘤和抗氧化成分时，得到了多个小分子化合物。如正十五醇（n-pentadecanol）、二十烷（eicosane）、十七烷（heptadecane）、二十一烷（heneicosane）邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate）、山嵛醇（behenic alcohol）等。

忧遁草是东南亚国家及泰国地区著名的中草药植物，常被用于治疗各种疾病，许多药效学研究已证明忧遁草在抗单纯疱疹病毒方面有其独特的效用[14，15]。临床上将忧遁草用于治疗生殖器疱疹及带状疱疹均也取得了较为良好的效果，临床效果表现良好[16]。忧遁草在抗病毒方面已有的研究主要包括以下几个方面：Kongkaew C等[17，18]研究忧遁草的提取物对HSV-1F的抑制作用，Vachirayon-stien T 等[19]指出在被病毒感染前，忧遁草提取物对HSV-2具有较为显著的抑制作用，其作用机制可能为忧遁草与病毒表面的某些分子相互作用而成。与此同时，Thawaranantha D等[20]采用 DNA 杂交技术研究，证明了忧遁草在抗人乳头瘤病毒（HPV）方面具有良好的抑制作用。有学者研究忧遁草茎叶部分4个不同萃取部位对免疫功能的效果评估，结果表明乙醇萃取物具有良好的免疫调节活性。有研究表明忧遁草茎的乙醇提取物对离体大鼠膀胱的抑制收缩作用优于叶的提取物[21]。在泰国及马来西亚等地，忧遁草还被用于治疗蛇咬伤。毒理学的相关研究亚急性毒性实验结果表明目前没有忧遁草甲醇提取物并对大鼠造成死亡及任何不利影响[22-24]。可见，忧遁草用作药物治疗疾病是无毒副作用或毒副作用较小。王瑶等[25]的研究结果表明忧遁草对小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用。

近年来，国内外学者研究发现忧遁草中不少成分具有抗氧化和清除自由基的功能并进行了一系列的实验。Pannangpetch P等[26]研究忧遁草的乙醇提取物抗氧化活性以及其对大鼠红细胞氧化性溶血的保护作用，结果表明忧遁草提取物在清除DPPH自由基具有良好的效果，同时还发现忧遁草提取物具有抗溶血的作用。Yong YK[27]等对DPPH自由基、NO自由基清除力，以及过氧化氢自由基的清除各个方面的抗氧化差异研究对比了忧遁草提取物的抗氧化能力强弱。Shiuan J等[28]研究结果表明忧遁草清除SOD活性较差，Ghasemzadeh A等[29]研究发现特定生长期忧遁草抗氧化活性明显高于其他生长期。

本文通过不同抗氧化实验方法评估产自揭阳和海南的忧遁草甲醇提取物的还原力，清除羟自由基的能力，以及清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH）能力和ABTS法来评价二者的体外抗氧化活性差异，并采用标准品水溶性维生素E（torlox）作为对照，揭示了忧遁草提取物的抗氧化活性，为忧遁草进一步开发利用提供了参考资料。

1 试验材料

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要试剂 详见表1。

1.1.2 主要仪器 详见表2。

2 实验内容与方法

2.1 忧遁草粗提物的提取 将忧遁草鲜叶置于80℃的烘箱中烘干8h，待其质量不再变化时，用中药粉碎机将其粉碎，用甲醇以1∶15的比例在55℃下萃取3h，共萃取3次，将萃取液置于55℃的旋转蒸发仪中蒸发，直至得到质量不再变化的浸膏。将浸膏移至50mL离心管中，用锡箔纸避光，4℃保存，备用。

2.2 还原力的测定 抗氧化物质能将Fe3+还原成Fe2+，Fe2+与铁氰化钾反应生成可溶性蓝色配合物K4Fe[Fe（CN）6]，该配合物的最大吸收波长在于700nm处。如果该物质的还原力越强，生成的K4Fe[Fe（CN）6]越多，其吸光度将越大。本实验中采用磷酸缓冲液（0.2mol/L pH6.6）和K3Fe[Fe（CN）6]（1%）各250μL，加入待测液200μL摇匀后，于50℃恒温水浴锅中反应30min，其后加入三氯乙酸（10%）250μL，4000r/min离心10min后，取上清液250μL，与蒸馏水250μL和Fecl3（0.1%w/v）50ul混合后，以磷酸缓冲液做参比，于700nm处测量吸光值。吸光值越大，则代表该物质的还原力越大[30]。

2.3 清除ABTS自由基能力的测定 准确称量19.2mgABTS和6.7mg的K2SO8分别溶于5mL的超纯水中配置成7.4mmol/L的ABTS的储备液以及2.6mmol/LK2SO8储备液的，完全溶解后，用锡箔纸避光反应12h，其后用无水乙醇将其吸光值调至0.7±0.02备用[31]。于96孔板中加入190μL的ABTS，其后往孔中添加10μL不同浓度的样品液，静置6min后，在734nm下测量其吸光值。

清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

式中：A0—空白对照的吸光度，AX—加入提取物吸光度，AX0—不加ABTS的本底吸光度。

2.4 清除DPPH自由基能力的测定 1，1-二苯基-2-苦基肼基自由基分子在519nm有最大的吸光值，当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长吸光度A值会与之减小。DPPH方法由于其溶液配置和使用方法均较为简单，因而被广泛的应用于各类抗氧化实验中。准确称量DPPH 8mg溶于50mL的乙醇中，配制浓度为0.4mmol/L的DPPH工作液体，在96孔板中加入90μLDPPH反应液，其次向孔板中加入不同浓度的样品10μL，将其避光反应30min后，于519nm处测量其吸光值[32]。

清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

式中：A0—空白对照的吸光度，AX—加入提取物吸光度，AX0—不加DPPH的本底吸光度。

2.5 清除羟自由基能力的测定 本实验采用Fenton反应产生羟自由基，选择过氧化氢作为氧化剂，在Fe2+催化下产生OH·，反应机理为：Fe2+ + H2O2—Fe3+ + OH- +OH·。在96孔板中，依次加入9mmol/LFeSO4溶液，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，不同浓度提取液和8.8mmol/L的H2O2各50μL。將其用锡箔纸避光置于37℃水浴锅中反应30min，使用蒸馏水做空白对照，于510nm处测定吸光值[33]。

清除率由以下公式计算得出：

清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

式中：A0—对照组的吸光度；AX—加入忧遁草提取物吸光度；AX0—不加H2O2的本底吸光度。

2.6 数据分析 本实验的数据均使用Excel和SPSS处理分析。

3 结果与分析

3.1 忧遁草提取物提取效率 本实验中忧遁草的采用的萃取溶剂为甲醇，经过测量可得，海南忧遁草的提取率为6.42%，揭阳忧遁草的提取率为7.73%。Yong YK等研究表明，在不同的烘干温度下，烘干温度高的提取率大于低温，不同温度下黄酮的提取率为80℃>60℃>50℃>40℃，在不同的萃取溶剂中，仅有冷水的萃取效率大于甲醇[34]。故本实验选取的烘干温度，以及萃取溶剂较为合理，达到较为理想的提取效果。

3.2 忧遁草提取物的还原力 还原力的大小代表一个抗氧化剂的电子供应能力的强弱。还原力较强的抗氧化剂不仅可以供应电子使Fe3+还原为Fe2+，同时也可以参与自由基的反应。样品在700nm处的吸光值的大小则代表了该物质还原力的强弱。本实验以torlox为标品，对比比较不同产地忧遁草提取物的还原能力的大小。实验结果表明，产自海南的忧遁草的还原力略低于产自揭阳忧遁草还原力，如图1、2可知，提取物的还原吸光值力随浓度升高而慢慢提高，呈现了较好的量效关系，在样品浓度为1mg/mL的时，两者吸光值并未达到1，在浓度为2mg/mL时，产自海南的忧遁草提取物还原力为0.87，产自海南的忧遁草还原力为1.069，标准品torlox在浓度为0.25mg/mL时，其吸光值超过1。实验结果说明忧遁草具有一定的还原力，但相比于标准品，其还原能力较弱。

3.3 忧遁草提取物清除ABTS自由基能力 ABTS法是一种常见的检测物质抗氧化的方法，以其检测方法简单，检测结果灵敏而被大量应用于抗氧化能力测试实验中，本实验结果如图3所示：海南忧遁草提取物达到50%清除率的浓度为0.485mg/mL，略高于产自揭阳的忧遁草提取物0.262mg/mL，而对照组中的torlox则在0.107mg/mL时对ABTS自由基的清除率即可达到50%。2种忧遁草提取物的对ABTS自由基的最高清除率均小于torlox，torlox的最大清除率可以达到95%，而2种忧遁草的最大清除率90%，比标准品略低5个百分点，实验结果证明两地的忧遁草提取物对ABTS自由基的清除效果较好。

3.4 忧遁草提取物清除DPPH自由基能力 由图4可知，产地不不同的忧遁草对DPPH自由基的清除能力有一定的差异，产自海南的忧遁草提取物的清除能力稍弱与产自揭阳的忧遁草提取物，且两种提取物的对DPPH自由基的清除能力均小于torlox，经过SPSS计算得知，产自海南的忧遁草提取物的IC50为0.893mg/mL，而产自揭阳的忧遁草IC50为0.685mg/mL，此时对照组torlox的IC50为0.278mg/mL。各个样品与清除率间体现了较好的量效关系，即随着提取物的浓度增强，其清除率也不断的增强，在提取物浓度为2mg/mL时，两种提取物的清除率均达到最大，最大清除率约为86%。

3.5 忧遁草提取物清除羟自由基能力 本方法采用Feton反应产生羟自由基，然后在体系中加入水杨酸以捕捉羟自由基使其反应产生有色物质，其后加入忧遁草提取物和torlox，与水杨酸竞争，使有色产物生成量减少，根据颜色的不同，即可在酶标仪下检测出其吸光值的变化，进而评价该提取物的抗氧化能力。实验结果显示，torlox和提取物均有清除羟自由基的能力，结果如图5所示，加入忧遁草提取液溶液后，能够有效地清除羟自由基，加入的提取物物浓度不同，清除羟自由基的能力不同；实验结果表明，揭阳忧遁草提取物的IC50为0.801mg/mL低于而海南忧遁草提取物的0.932mg/mL，证明了前者对自由基的清除能力大于后者，同时，torlox的IC50为0.362mg/mL。从图中的曲线可以看出，不同浓度的忧遁草均具有一定的清除自由基的能力。且清除能力与样品的浓度呈量效关系，忧遁草提取物在2mg/mL时的最大清除率仅为70%，而torlox在1mg/mL的清除率为89%。

4 讨论与结论

4.1 讨论 由于不同的抗氧化方法之间的原理存在一定的差异性，因此，物质的抗氧化能力不仅会受不同的反应原理的影响，也会因为同一种方法采用的不同浓度以及配比方式的不同而导致实验结果的差异，在不同的抗氧化结果中，许多研究者采用了不同标准品对照，也使得抗氧化的实验结果之间难以比较[34]。采用不同的方法评估同一种物质的抗氧性是非常必要的，因为单一的抗氧化检测方法难以体现某种抗氧化物质的抗氧化活性[35]。在本实验中，实验者采取了多种实验方法评估不同产地忧遁草的抗氧化活性，并采用torlox作为参照，对比评估不同产地忧遁草的抗氧化活性。本實验中，为了准确的评估和对比来自不同产地的忧遁草提取物的抗氧化能力，采用4个方法评估其抗氧化能力，实验结果表明，2种忧遁草的提取物均有较好的抗氧性，产自揭阳的忧遁草提取物较之于产自海南的忧遁草提取物总体上显示出了更好的抗氧化结果，在4个评价方法中，2种提取物对ABTS与DPPH自由基的清除能力更强，而在羟自由基与还原力的方法测评上表现稍差，实验结果较为全面地体现了忧遁草的抗氧化能力，表明忧遁草具有较好的抗氧化能力。

4.2 结论 还原力的测定结果显示产自海南的忧遁草的还原力略低于产自揭阳忧遁草还原力。在浓度为2mg/mL时，产自海南的忧遁草提取物700nm处吸光度为0.87，产自揭阳的忧遁草的吸光度为1.069。ABTS自由基清除能力的测定中，海南忧遁草的IC50为0.494mg/mL，揭阳忧遁草IC50为0.262mg/mL，实验结果表明，2种忧遁草对ABTS自由基清除效果好，该方法测试灵敏度较高。在DPPH自由基清除能力的测定结果显示，产自海南的忧遁草提取物IC50分别为0.895mg/mL，产自揭阳忧遁草提取物IC50为0.685mg/mL，该结果能够较好的评价其抗氧化性。本实验中还采用了羟自由基的清除能力对忧遁草的抗氧化性进行评价，通过将2种不同产地的忧遁草提取物和torlox的清除率对比发现，该方法检测灵敏度效果不明显，海南忧遁草的IC50为0.932mg/mL，揭阳忧遁草IC50为0.801mg/mL，标准品torlox IC50为0.362mg/mL。

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（责编：张宏民）