药用植物研究中的分子标记技术应用进展

陈红波++余金芮++杨春先++钱刚

摘要：通过对近年来常用分子标记技术的原理、技术特点及其在药用植物研究领域中应用现状的总结，以期为药用植物资源开发与评价提供参考，也进一步为药用植物功能基因的筛选和验证提供思路。

关键词：分子标记；药用植物；简单序列重复（SSR）；扩增片段长度多态性（AFLP）；单核苷酸多态性分析技术（SNPs）

中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）13-2401-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.001

Progress and Application of Molecular Marker Technology in Medicinal Plants

CHEN Hong-boa， YU Jin-ruib， YANG Chun-xianb， QIAN Ganga

（a.Department of Cell Biology and Genetics； b.School of Dentistry， Zunyi Medical College， Zunyi 563003， Guizhou， China）

Abstract： By summarizing the principle and technical characteristics of the commonly used molecular marker technology in recent years and its application in the field of medicinal plant research，this paper provides a reference for the development and evaluation of medicinal plant resources， and further provides ideas for the screening and verification of functional gene of medicinal plants.

Key words： molecular marker； medicinal plants； simple sequence repeat（SSR）； amplified fragment length polymorphisms（AFLP）； single nucleotide polymorphisms（SNPs）

中國是野生中药材资源最为丰富的国家，目前已识别有11 000多种，无论其种类或数量均列世界之首[1]，为中国中药文化产业的国际化创造了丰富的资源条件。但近年来，随着人们对养生、保健等意识的不断提高，导致中药材的市场需求极度扩增，一些以野生种质消耗为主的名贵中药材正面临濒危甚至灭绝。传统的研究利用方法在药用植物识别、开发、利用以及保护等方面都相对落后。然而近些年，以RFLP[2]为代表的DNA分子标记技术的兴起，为实现当代药用植物研究的现代化提供了现实手段与条件。分子标记技术（亦或分子鉴别技术或DNA分子标记技术）[3，4]，是一种基于遗传物质的研究方式，这使其具备了不受生长环境的影响、检验精度高及重现性好等优点。随着DNA分子标记技术的不断运用与革新，以分子杂交为基础的第一代标记技术，由于操作过程复杂、周期长等原因，正逐渐退出分子研究领域。而围绕PCR技术为核心的新型分子标记技术正广为使用，并日臻成熟。

1 常用分子标记技术的原理及特点

1.1 简单序列重复（Simple sequence repeat，SSR）

SSR亦称为微卫星DNA，它由2-5个碱基组成，如（GA）n、（TG）n、（GAC）n等，其中最常见为二核苷酸重复形式。SSR序列的长度在不同基因组间由于重复次数以及程度的不同具有高度的变异性，而展现出较高的多态性。SSR标记原理是根据其两端的保守序列设计特异性引物，经过PCR扩增后，再利用变性或者非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，继而体现不同样本基因组DNA的多态性。

简单重复序列具有较多优点，其共显性可区分纯合型与杂合型，以及还有灵敏度高、稳定性好以及操作简便等优点。但目前SSR获得的方式参差不齐，前提都是要提前知道目的基因的序列信息。

1.1.1 简单重复区间序列（Inter-simple sequence repeat，ISSR） ISSR是Zietkiewicz等[5]于1994年发展起来的一种加锚SSR技术。它的原理是在SSR引物的5′或3′端锚定2个或以上的SSR碱基，引起特定位点退火，从而提高扩增专一性，得到的特异性片段再通过变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离，最后根据不同的多态性条带分析多态性。

其优点在于无需提前知道样品基因序列，ISSR可为研究者快速高效地提供基因组信息；引物序列相对较长，通过提高退火温度进而保证了结果的可靠性；样本DNA质量要求不高，且所需量少；引物的通用性广，不具种属特异性。但在实际应用中也存在一定缺陷，如：稳定的实验体系条件需要探索构建，且显性标记亦不能区分纯合型和杂合型。

1.1.2 表达序列标签（Expressed sequence tags，ESTs） 表达序列标签是基于EST数据库或cDNA文库的一种标记技术，是一种能快速、高效地揭示基因容量的标记方法，由1989年Venter首次提出。它能特异地展示出基因某一位点的表达情况，能够直接反映出功能基因的生物信息[6]，同时也为地道药用植物的鉴别、开发利用提供了新的候选基因。因此，基于ESTs开发的SSR技术（即EST-SSR）是一种稳定、可靠的分子标记技术[7]，可直接用于基因作图[8]，从而指导功能基因的预测。

EST-SSR与传统SSR技术相比较，无需构建DNA文库而节约了实验成本。而且，在功能基因研究方面，EST-SSR更接近功能基因组；表达序列标签直接来源于编码序列，从而为基因组比较学以及同源基因的研究提供更可靠的途径。但也有不足之处：与SSR相比，多态性较低；同时，ESTs只代表了基因组DNA的一部分，所包含的信息不够全面，且现行的一些序列拼接软件也存在一定的局限性，分析过程中也可能丢失一些重要的基因组信息。

1.2 扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphisms，AFLP）

AFLP是1992年荷兰科学家Zabeau和Vos发明的一项新专利[9]。其原理是植物基因组DNA经过限制性内切酶酶切后（通常采用双酶切），与特定的接头相结合而得到带有特定接头的特异性片段，这些片段再与PCR引物的3′端识别后进行特异性扩增，最后再将扩增产物通过聚丙烯酰氨凝膠电泳筛选，进而分析其多态性。

AFLP是RFLP技术与PCR技术的结合，其具备了高多态性、操作简易、可以同时处理大量样品等优点。近年来，AFLP已广泛应用于药用植物遗传图谱的绘制、物种遗传多样性分析及分类研究、辅助育种、功能基因定位等多方向的研究[10，11]，且AFLP目前已被公认为构建DNA指纹图谱最可靠的分子标记。其缺点主要是对样品DNA的质量要求较高，实验成本也较昂贵，扩增所得结果的分析也相对困难。

1.3 DNA条形码技术

2003年Guelph大学的Hebert等首次提出DNA条形码的概念。它是以足够变异且相对较短的DNA序列为标准，建立的一种新的生物身份鉴别系统，从而实现对物种快速、精准地识别和鉴定，其类似于超市使用条形码鉴别不同商品。通过特异DNA的比对，对于新种和隐种的发现也具有现实性的帮助[12]。Lahaye等[13]通过单独使用matK基因对1 000多种兰科植物进行系统分析，结果证明单独使用matK基因能够发现兰科隐种并证明了DNA条形码分析的可行性；Newmaster等[14]运用DNA条形码技术发现了感应草属的3个隐种以及草沙蚕属的1个新种。在2008年召开的植物无国界会议上提出了“超级条形码”技术[15]，决定将叶绿体全基因组序列作为条形码序列应用在植物物种的鉴别上。Shinozaki等[16]第一次完成了单一物种叶绿体全基因组的测序；2008年Diekmann等[17]又提出了一套较为标准的叶绿体DNA提取方法。Parks等[18]通过对松属37个样本进行叶绿体全基因组测序分析，验证了叶绿体基因组可以作为植物物种水平上的条形码。近年来，DNA条形码技术在药用植物研究中的报道也逐渐增多，对于加快中国生物进化研究的步伐具有重要意义[19，20]。

1.4 基因芯片技术

基因芯片又称DNA芯片或寡核苷酸阵列，它是将大量已知的探针固定在支持物上[21，22]，通过核酸杂交，再利用激光扫描及分析，来实现对目的基因表达水平或多态性的分析。其高通量、自动化的优势使其广泛用于基因的定位、药物的靶向分析及新药研发中。Schena于1995年第一次在论文中发表了DNA chip相关研究，Fodor又于第二年年底研制出了第一块DNA芯片[23]。

基因芯片技术目前主要应用于一些新药的研发[24，25]、药物靶向研究以及疾病的诊断等方面。Watanabe等[26]采用高密度基因芯片技术，对经 Egb761处理的小鼠的皮层和海马细胞的基因表达进行了研究，分析得出其具有拮抗神经病变的药理作用。李美德[27]应用全基因组表达芯片来检测从黄芩根中分离出的汉黄芩素作用于肝癌细胞后的基因表达情况，结果发现406个差异明显的表达基因，通过差异基因的筛选和分析，从而确定了汉黄芩素抗肝癌的分子机制，对药物靶向基因的确定，以及抗癌药物的开发提供了新的依据。郭旭东[28]通过基因芯片技术对急性心肌梗死（AMI）患者和健康者外周血的RNA进行差异分析，发现其中的差异基因CYP4F3和USP25可能为AMI诊断的基因标记。张玉金等[29]通过利用从中国2010年版药典中筛选出的基原植物以及从NCBI数据库中下载的相应序列进行分析，得到13 814条特异性探针，为中国药典中基原植物检测芯片的建立做出了重要贡献。近年来，不同领域的实用芯片陆续都有报道，且基因芯片技术目前已是高通量药物筛选的主要途径，同时也是中药活性成分筛选的重要手段。

1.5 单核苷酸多态性分析技术（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）

SNPs是等位基因之间的单个核苷酸差异，如单个核苷酸的缺失、插入或者是突变等[30]。SNPs标记技术相比微卫星技术而言，SNPs描述的是一种双等位基因的多态性，而SSR则是多位点等位基因之间的多态性，故SNPs在数量上远远超过SSR，因此具有更高的多态性。在人的基因组中，大概1 000 bp就会出现一个SNP，因此可以其作为DNA的一种特异性标记[31]。Xu等[32]通过对水稻亲本9 311的SNP检测，得到了768万个多态位点，从而绘制了1张高密度的Bin图谱并成功定位了1个QTL。目前，由于SNP技术主要依靠于基因组DNA的大量测序或者是基因芯片技术，且技术要求高以及实验成本大等原因，导致在药用植物方面的研究也相对匮乏。

2 DNA分子标记技术在药用植物中的研究应用

2.1 中药材种质资源的鉴定、评价及道地性研究

种质资源是指亲本遗传给子代的遗传物质，其包括“道地性”种质资源、新种及重要培育品系等。徐蕾等[33]通过运用SSR标记技术在铁皮石斛种群遗传多样性的研究，证实了铁皮石斛具有较高的遗传多态性，并顺利将36份铁皮石斛材料分成了3个类别。Shen等[34]利用筛选出的ISSR引物准确地鉴别出了8个野生种石斛药品。李永清等[35]利用ISSR技术成功将36份铁皮石斛材料划分为6个类群。赵香妍等[36]通过ISSR标记技术在北京地区野生柴胡种质资源中的研究，得出北京地区野生柴胡具有一定的地域性分布特征，应加以保护及推广种植。

2.2 中药材真伪的鉴别及品种鉴定

随着中药材市场需求的不断扩大，中药材市场鱼目混珠的情况时有发生，同类药材由于道地性等导致药效也相差甚远，而常规的检测方式却很难区别。但现行的DNA分子鉴别技术基于高稳定性、不受环境因素及个体发育影响等优点，可以保证鉴定结果的准确性。马晓冲等[37]通过研究证明基于SNP的分子标记技术能够稳定地鉴别中药材泽泻。滕艳芬等[38]利用matK基因已成功将正品与混淆产品鉴别开来。

2.3 遗传多样性及种属亲缘关系的研究

药用植物遗传多样性及亲缘关系的研究，对于认识物种的进化历程、遗传育种及物种改良等均具有重要意义。传统的研究方法均是基于对表达产物的研究探索，但药用植物的化学成分及其含量、外部形态等均会由于生长环境及其他因素影响而有所差别。因此，从传统研究的角度探索药用植物的遗传多样性就存在很大的局限性，而从分子角度出发的分子标记技术能有效地揭示物種进化演变过程中遗传物质流动的真实本质，从而使得分子标记技术能够阐明物种进化、遗传背景以及种内或种间遗传关系，为中国珍贵及濒危中药材的开发、利用和资源保护提供真实依据。

近年来，随着分子标记技术的不断应用与发展，已有多种DNA标记技术成功运用于中药材遗传多样性研究及亲缘性分析中。YANG等[39]运用SSR分子标记技术对吉林省5个不同产地的人参材料进行分析，得出不同产地的人参在遗传物质上呈现出较高的多态性。Li等[40]于2013年利用SSR标记法对洋玉兰叶绿体全基因组进行近缘物种比对分析，结果显示洋玉兰叶绿体基因组的重复序列保守性相对较高。2014年，Galina等[41]又运用SSR标记技术对俄罗斯濒临灭绝的人参进行了种群遗传性状的分析。朱田田等[42]利用ISSR对甘肃不同产地中麻黄的遗传关系进行了分析，得出中麻黄遗传距离跟地理距离有一定的关系。黄颖桢等[43]通过使用ISS标记技术对金线莲遗传多样性进行分析，得出在野生种质资源间金线莲具有丰富的遗传多样性。叶炜等[44]通过利用ISSR对金线兰及其近缘物种的遗传多样性进行研究，得出种群间可能存在基因的交流。唐晓清等[45]利用AFLP技术对不同农家栽培类型的丹参进行分析，结果表明AFLP技术可以作为识别丹参不同栽培类型间遗传差异的手段。李勇等[46]利用AFLP技术通过对金莲花遗传多样性的研究，得出地理位置较近的种质遗传相似度较高。唐美琼等[47]利用AFLP技术对广西草珊瑚遗传性状进行研究分析，结果显示广西草珊瑚遗传多样性偏低，须尽快采取相应措施。沈亮等[48]通过AFLP技术分析梭梭遗传多态性得知该物种种内丰度较高，各地区之间的分化较小。李永清等[49]通过ISSR在37份药用石斛亲缘关系研究中的应用，得出ISSR分子标记技术完全可以应用于石斛物种亲缘关系的分析。朱田田等[50]通过对不同黄芪和党参栽培品种遗传关系的ISSR分析，得出不同品种的黄芪和党参拥有较高的遗传多样性，而且种间差异较大。蒋雨晗等[51]利用ISSR分子技术对14份不同来源的白芍进行研究分析，证明了4个栽培种跟野生种之间有一定的遗传差异性，而且可以从基因水平把外型相似的白芍栽培品种区别开来。

2.4 DNA遗传图谱的构建及数量控制基因定位

DNA遗传图谱也称基因遗传图谱或连锁图谱，系指基因在染色体上相对应的位置。自从第一张遗传图谱的构建以来，越来越多关于药用植物DNA图谱的构建也相继报道。周志勇等[52]首次用AFLP技术构建了人参和西洋参的DNA指纹图谱，这对人参的鉴别提供了非常有效的工具。虞泓等[53]利用AFLP对石斛4个内种和1个外群种进行DNA多态性分析，用筛选得到的引物构建了5个种的DNA图谱，并应用bootstrap进行了检验，该研究证明了AFLP标记技术可用于构建石斛基因组指纹图谱。赵红燕[54]则利用EST-SSR、ISSR、RAPD、SRAP等4种分子标记技术成功构建了浙江铁皮石斛563个遗传连锁。郑伟耀等[55]运用SSR标记天麻基因组DNA，分析得出扩增位点与天麻素含量有关。巫桂芬等[56]通过黄麻基因DNA分子指纹图谱的构建，得出每一种被识别出的物种均有其特有的分子“身份证”。

3 展望

中国药用植物种质资源非常丰富，但是近年来由于气候的变化以及过度的开采，使得一些稀少的野生药材资源更是急剧减少，市场也相对混乱，因此从生物本质出发的DNA分子标记技术对于中国药用植物的鉴定、保护、开采、利用及改造就显得格外重要。目前，分子标记技术在药用植物中的研究主要体现在遗传多样性研究、种质鉴别及评价、DNA指纹图谱构建以及基因定位几个方面。

目前在药用植物研究应用中的DNA分子标记技术尚存在以下几个问题：DNA标记技术在中药材研究中的应用较少，而且存在方向聚集现象，近年关于药用植物亲缘性的研究越来越多，然而在其他一些领域，如药材活性成分分离与提取以及相关成分控制基因定位等方面的研究却少有报道，研究范围不够全面和深入。另外，每一种分子标记技术都有其各自的优缺点，实验结果具有一定片面性，而标记技术的联合应用也处于相对空白状态；技术要求高，技术培训相对缺乏。因此，需要加大分子标记技术的研究应用，以便增加其在药用植物研究中的实用性和可靠性，通过以不同分子技术的研究为基础，可达到明确中药材有效药用成分的基因构成，以及各种药用植物基因的调控原理及产物的靶向作用原理，以便对中国中药品种的保护利用及产业化做出更大的贡献，以此实现中国中药文化的规范化、产业化以及国际化。

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