马樱丹水提液抗全齿复活线虫研究

陶红丽，沈清清，李雪婷，李文强，陈文燕，胡艳琼

（文山学院 环境与资源学院，云南 文山 663099）

马樱丹水提液抗全齿复活线虫研究

陶红丽，沈清清，李雪婷，李文强，陈文燕，胡艳琼

（文山学院 环境与资源学院，云南 文山 663099）

通过研磨和熬煮的方法分别提取马樱丹茎、叶、花的水提液，并测定其对全齿复活线虫的毒杀效果。结果表明：研磨方法提取的马樱丹叶、花、茎水提液原液处理线虫72 h时，死亡率分别为100%、100%、80.52%；熬煮方法提取的马樱丹叶、花、茎水提液原液处理线虫72 h时，死亡率分别为100%、91.76%、70.03%；其中叶的杀线虫活性最强，花，茎次之；马樱丹水提液中毒杀线虫的有效物质具耐高温性，随着稀释倍数的增大，水提液对线虫的毒杀效果逐渐减小，当稀释倍数大于4倍时，杀线虫活力显著下降，表明马樱丹不同部位的水提液抗线虫活性与其浓度呈正相关。

马樱丹；线虫；毒杀活性；防治；死亡率

线虫是一类比较低等和简单的无脊椎软体动物，分布广泛，种类繁多，是植物病害的主要病原之一，危害较大，据统计，全世界范围内每年因线虫给农业和林业生产带来的损失高达32%。[1]线虫的防治方法众多，其中化学防治法是最主要的、也是应用最广泛的防治措施，但是化学药剂的长期使用带来了一些不好的影响，例如土壤板结，环境严重受到污染等。当务之急便是开发出能取而代之的既经济又环保的新型高效杀线剂生物农药。因此利用植物天然活性物质开发出成本低、对寄生线虫有害、对人及其他非靶标生物安全、可生物降解、且降解产物对环境无不良影响的天然的新型、环保型生物农药成为了新的研究热点。[2-3]近年来，我国众多科研人员如翁群芳[4]、邱雪柏[5]、苏秀荣[6]、江春[7]等陆续开展了多种植物源杀线虫活性物质的研究，发现夹竹桃、万寿菊、马钱、银胶菊、骆驼蓬、黄文江鱼藤、桃花心木、油椒、茵陈蒿等植物提取液对农林病原线虫均具有显著毒杀效果。

马樱丹（Lantana camara）原产于美洲，在其产地侵占了大面积的牧场和耕地，现分布于近50个国家，被列为Ⅱ级危害程度的外来入侵植物，其治理是世界级难题。目前已从马樱丹植物组织中提取出了挥发油、酚酸类和黄酮类等化感物质，马樱丹的叶与花中挥发出的气味，具有很强的驱蚊效果，但对人体无害。如果将它作为资源和产品原材料加以转化利用，开发成为绿色肥料和天然杀线虫剂，一方面将带来巨大的经济价值，另一方面带来的是双向性的环保价值。本文首次研究了马樱丹的水提液对线虫的抑制效应，以期为进一步开发和利用马樱丹提供实验依据，并为研制和开发各种天然杀线剂、杀虫剂、杀菌剂、生物农药等提供了新的研究思路和方法。

1 供试材料与方法

1.1 供试植物

供试植物：马樱丹 （茎、叶、花等三个部位），采自云南省文山市。

1.2 线虫的培养

供试线虫：全齿复活线虫 （Panagrellus redivivus），由云南大学微生物资源开发和利用重点实验室提供。

1.2.1 供试线虫的培养与分离

200 mL三角瓶中装入30 g燕麦，加入无菌水混匀后121℃、0.1 MPa条件下灭菌15 min，冷却后接入全齿复活线虫原种，置于摇床培养箱中，28 ℃条件下培养6～8 d。之后参照贝曼氏漏斗法（Bearmen）[8]分离线虫。

1.3 供试植物水提液的制备

植物材料分为2组，每组材料称取新鲜马樱丹的茎、叶、花各1份样品，每份样品100 g。实验1组的材料经过消毒处理后放入研钵中，加入少量石英砂和无菌水后研磨均匀呈浆状，定容至50 mL，浸提24 h无菌滤纸过滤后用离心机在4 000 r/min 条件下离心10 min，除去残渣后用无菌水再次定容至100 mL，使水提液的质量浓度为1.0 g/mL；实验2组的材料分别放入不锈钢容器中，加入适量水熬煮30 min，无菌滤纸过滤后用离心机在4 000 r/min 条件下离心10 min，用无菌水定容到100 mL，质量浓度为1.0 g/mL。

2 抗线虫活性研究

将马樱丹的茎、叶、花经过研磨处理和熬煮处理后获得的水提液母液进行不同倍数的稀释，在无菌条件下用移液器分别取不同倍数的稀释液3 mL置于小培养皿中（直径2 cm），之后在每个小培养皿中加入100条全齿复活线虫，另取3 mL无菌水加入培养皿后再放入100条线虫（空白对照），每个样品设3个重复，将所有样品同时放入培养箱培养72 h，温度设为28℃。当处理时间达24 h、48 h和72 h时，分别将所有样品取出在解剖镜下用“针触法”记录全齿复活线虫的死亡率。[9]死亡率的计算方法参照“式（1）”，校正死亡率的方法参照“式（2）”。线虫死亡率计算标准参见蔡秋锦1998年发表的方法。[10]

线虫死亡率（%）=（死亡线虫数/供试线虫数）×100 % （ 1）

线虫校正死亡率（%）=[（处理组线虫死亡率－对照组线虫死亡率）/（1－对照组线虫死亡率）]×100%（2）

水提液的杀线虫活性强弱按5个等级区分[11]：校正死亡率≤10%，表示无杀线虫活性，用符号“－”标注；校正死亡率为10%～30%，表示杀线虫活性弱，用符号“＋”标注；校正死亡率为30%～50%，表示杀线虫活性中等，用符号“＋＋”标注；校正死亡率为50%～80%，表示杀线虫活性较强，用符号“＋＋＋”标注；校正死亡率>80%，表示杀线虫活性强，用符号“＋＋＋＋”标注。

3 实验数据处理

采用SPSS 16.0软件和Microsoft Excel 2003对结果进行统计分析，以P＜0.05为显著差异。

4 结果与分析

4.1 马樱丹研磨水提液对线虫的影响

由表1可见，叶的水提液稀释2、4、8倍处理72 h后，对全齿复活线虫的毒杀效果均较好，叶的水提液校正死亡率依次为95.88%、84.27%、63.29%；花的水提液校正死亡率依次为88.01%、71.91%、54.68%；茎的水提液稀释成2、4、8倍处理72 h后，对全齿复活线虫的毒杀效果也较好，校正死亡率分别为71.54%、57.68%、36.33%。因此，由表1分析可知，叶和花的水提液对线虫的毒杀活性最大，即使将其稀释至8倍，仍具有较强的活性，茎的水提液毒杀活性相对较弱。另外，马樱丹水提液的浓度对抗线虫活性具有显著的影响，随着马樱丹水提液稀释倍数的增加，抗线虫活性逐渐降低。

表1 马樱丹研磨水提液不同浓度对全齿复活线虫的毒杀活性

4.2 马樱丹熬煮水提液对线虫的影响

由表2可见，叶和花的水提液稀释2、4、8倍处理72 h后，对全齿复活线虫的毒杀效果都较好，叶的水提液处理校正死亡率依次为85.39%、69.29%、46.07%；花的水提液处理校正死亡率为80.15%、65.54%、65.91%；茎的水提液稀释成2、4、8倍处理72 h后，对全齿复活线虫的毒杀效果稍弱，校正死亡率分别为60.05%、38.95%、14.23%；因此，由表2分析可知，叶和花的水提液对线虫的毒杀活性最大，即使将其稀释至4倍，仍具有较强的活性；马樱丹熬煮水提液的不同浓度对抗线虫活性具有显著的影响，随着马樱丹水提液稀释倍数的增加，抗线虫活性逐渐降低；另外高温处理条件下获得的马樱丹水提液仍然具有很强的杀线虫活性，表明其水提液中的有效杀线虫物质具有耐高温的特性，不属于生物酶类物质。

表2 马樱丹熬煮水提液不同浓度对全齿复活线虫的毒杀活性

4.3 采集部位对全齿复活线虫毒杀活性的影响

4.3.1 研磨水提液

由图1至图4可知，同等浓度下马樱丹杀线虫的活性最强的部位是叶，其水提液母液24 h后校正死亡率达98.96%，48 h为93.91%，72 h达到100%，其活性强度保持强（+ + + +），稀释8倍后其水提液对线虫的校正死亡率24 h时为31.25%，48 h时为59.14%，72 h时为63.29%，仍保持较高活性。

图 1 不同部位研磨水提液稀释1倍3个处理时间对线虫的影响

图 2 不同部位研磨水提液稀释2倍3个处理时间对线虫的影响

图 3 不同部位研磨水提液稀释4倍3个处理时间对线虫的影响

图 4 不同部位研磨水提液稀释8倍3个处理时间对线虫的影响

4.3.2 熬煮水提液

由图5至图8可知，同等浓度下马樱丹的杀线虫的活性最强的部位仍然是叶，其水提液母液作用24 h后校正死亡率达82.69%，48 h为87.81%，72 h达到100%，其活性强度保持强（+ + + +），稀释8倍后其水提液母液对线虫的校正死亡率24 h时为21.18%，48 h时为32.97%，72 h时为46.07%，仍保持中等活性。

图 5 不同部位熬煮水提液稀释1倍3个处理时间对线虫的影响

图 6 不同部位熬煮水提液稀释2倍3个处理时间对线虫的影响

图 7 不同部位熬煮水提液稀释4倍3个处理时间对线虫的影响

图 8 不同部位熬煮水提液稀释8倍3个处理时间对线虫的影响

5 结论

1）马樱丹的水提液母液杀线虫活性效果最显著，将母液稀释2、4、8倍后，随着稀释倍数的增大，对线虫的毒杀效果逐渐减小，当稀释倍数大于4时，杀线虫活力显著下降，说明马樱丹不同部位的水提液抗线虫活性与其浓度呈正相关。

2）马樱丹不同部位水提液抗全齿复活线虫活性研究表明，叶、花、茎3个不同部位水提液对全齿复活线虫均有不同程度的毒杀活性，其中叶的活性最强，不管是叶研磨水提液还是熬煮水提液稀释4倍时杀线虫率仍能达50%以上；而茎的活性相对较低，水提液对全齿复活线虫的毒杀作用随着时间的延长而有增强的趋势。

3）马樱丹水提液中毒杀线虫的有效成分具有耐高温性，其活性物质不属于生物酶。

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[5]邱雪柏，向红琼，姜自清. 22 种植物甲醇提取液对南方根结线虫的控制作用[J]. 贵州农业科学，2008（6）：70-71.

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（责任编辑 张 铁）

A Research on Resistance of Lantana Camara Extracts to Panagrellus Redivivus

TAO Hongli, SHEN Qingqing, HU Yan, LI Xueting, LI Wenqiang, CHEN Wenyan, HU Yanqiong
(School of Resources and Environment, Wenshan University, Wenshan Yunnan 663099, China)

The aqueous extract solution of lantana camara stem, leaf and f l ower is extracted by the methods of grinding and boiling. In addition, the poison effect of it on panagrellus redivivus is measured. When the aqueous extract solution of lantana camara stem, leaf and f l ower extracted by the method of grinding is used to process nematode for 72h, the death rates are100%, 100% and 80.52% respectively. When the aqueous extract solution of lantana camara stem, leaf and f l ower extracted by the method of boiling is used to process for 72h, the death rates were 100%, 91.76%, and 70.03% respectively, which indicated that the nematocidal activity of leaf is the strongest, and then f l ower and stem are the secondary. in addition, it also indicates that the active substance poisoning nematode in aqueous extract solution has the property of high-temperature resistance. With the dilution ratio increasing, the poison effect of aqueous extract solution on nematode is declining. When the dilution ratio was greater than 4 times, the nematocidal activity declines signif i cantly, which indicates that the nematocidal activity on different parts of lantana camara is positively associated with its concentration.

Lantana camara; nematode; toxicity; resistance; mortality

S432

A

1674 - 9200（2017）03 - 0116 - 05

2016 - 09 - 19

陶红丽，女，彝族，云南楚雄人，文山学院环境与资源学院2012级生物科学专业本科生；沈清清，女，云南文山人，文山学院环境与资源学院副教授，硕士，该文指导教师，主要从事微生物资源与生物信息学研究；李雪婷，女，云南昆明人，文山学院环境与资源学院2013级生物科学专业本科生。