长药景天根际抗Zn菌株的分离、筛选与鉴定

王莹 王竞红

(东北林业大学，哈尔滨，150040)



长药景天根际抗Zn菌株的分离、筛选与鉴定

王莹 王竞红

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

以长药景天盆栽到Zn质量分数为800 mg·kg-1的根际土壤为研究材料，对根际抗Zn菌株进行富集、分离后，筛选出6个抗Zn菌株，编号分别为Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6。从形态学、生理生化、分子生物学角度进行鉴定，结果表明：Zn1和Zn4均属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，相似度分别达到99%和98%；Zn2与黄色单胞菌属(Xanthomonas)相似度达到97%；Zn3、Zn5和Zn6与肠杆菌属(Enterobacter)的相似度均为97% 。

长药景天；根际；抗Zn菌株；菌株分离；菌株筛选；菌株鉴定

Hylotelephiumspectabile； Rhizosphere soil； Strains resisted Zn； Strains separation； Strains screening； Strains identification

重金属Zn是动植物所必需的微量元素，但如果重金属Zn超标会导致一系列不良的危害，包括动物、人类[1-2]、植物[3-5]、农作物[6]等，而这一切Zn的污染大多数来源于土壤，土壤中Zn污染的来源十分广泛，所以治理土壤Zn污染是迫在眉睫的头等大事。关于重金属污染修复的方法有很多，例如，物理法、化学法等，但都由于其工程量大、处理费用高而不能广泛应用，目前的生物修复技术中利用微生物处理重金属Zn污染土壤是目前最有前途的一种重金属污染处理方法，具有生态效益高、成本低、适用范围广等优点，具有很高的研究价值[7]。文中通过实验室模拟盆栽试验的基础上，取长势较好的耐Zn植物长药景天根系附近的土壤，进行耐性菌株的分离、纯化、筛选，通过形态、生理生化特性、16SrDNA三个层次进行鉴定，为今后Zn污染提供菌株资源，为生物修复研究提供基础数据[8]。

1 材料与方法

菌株来源：菌株筛选于Zn质量分数为800 mg·kg-1长药景天所生长的根际土壤。

培养基：细菌培养基、LB培养基、淀粉培养基、油脂培养基、蛋白胨水培养基、柠檬酸盐培养基、明胶培养基、醋酸铅培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、尿素琼脂培养基、菌膜培养基、卵黄琼脂培养基、七叶苷培养基、苯丙氨酸培养基。

供试植物的培养与处理：长药景天属喜旱植物，为使其根部具有良好的透气性、防止烂根，在培养植物的土壤中添加砂子。添加标准为m(花土)∶m(砂子)=1∶1。将黑壤花土与砂子充分搅拌混匀，进行称量，每个花盆1.5 kg花土，选择生长健康、长势一致且生长在质量分数为800 mg·kg-1土壤中的长药景天，在此胁迫条件下培养35 d，再对其植物根际土壤进行取样，以确保植物根际建立完整菌群。

抗Zn菌株的分离与纯化：取土样0.1 g溶于100 mL培养液中，在振荡培养箱中25 ℃恒温培养48 h，用移液枪取1 mL培养液转接到Zn质量浓度为800 mg·L-1的液体培养基(100 mL)中，继续培养48 h，反复操作以上步骤5次。

将上述菌液分别取适量稀释一定的倍数，取0.1 mL稀释液滴加在固体平板(Zn质量浓度为800 mg·L-1)中央，立即涂抹均匀。接种后移入恒温培养箱中倒置，25 ℃恒温培养48 h，直到培养基表面观察到菌落。根据不同形态的菌落，挑取单菌落，移种转接到培养基中，然后放入恒温培养箱中培养48 h。上述操作反复进行，同时用显微镜检查，直至获得纯菌株[9]。将分离纯化得到的菌株接种于液体细菌培养基，培养后加入甘油，使甘油的最终溶液质量分数达到10%，置于-80 ℃进行保存。

菌株的形态学鉴定：将分离出的菌株用无菌水稀释，均匀涂布于筛选培养基的平板上，倒置于培养箱中37 ℃培养48 h。观察菌落表面形态、大小、颜色、黏稠度、透明度、边缘形态等方面，并记录结果。用电子显微镜对菌株进行了电镜观察。

菌株的生理生化鉴定：淀粉水解试验、油脂水解试验、吲哚试验、甲基红试验、柠檬酸盐试验、明胶水解试验、硫化氢试验、V.P.试验、纤维素试验、尿素试验、过氧化氢试验、菌膜形成试验、产氨试验、卵磷脂试验、七叶苷试验、苯丙氨酸脱氢酶试验，参照《常用细菌系统鉴定手册》[10]和《伯杰细菌鉴定手册》[11]完成。

菌株的分子生物学鉴定：16SrDNA是目前被广泛用于研究细菌遗传特征和分类研究的方法[12-13]。通过琼脂糖凝胶电泳的检测，将带有16SrDNA检测片段的菌液送至上海生工生物技术公司进行测序。将测得的16SrDNA基因序列提交到NCBI Genebank中进行相关序列的同源性比对。

2 结果与分析

2.1 抗Zn细菌的分离与筛选

通过对长药景天根际土壤中菌株的分离、纯化与筛选，从长药景天根际获得抗Zn菌株6株，编号分别为Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6。

2.2 菌株的形态学鉴定

6株菌株均为革兰氏阴性菌，均为杆菌(表1，图1)。

表1 6株抗Zn菌株的形态特征

注：—表示革兰氏阴性细菌。

1．Zn1；2.Zn2；3.Zn3；4.Zn4；5.Zn5；6.Zn6。

2.3 菌株的生理生化鉴定

不同细菌对糖、脂肪和蛋白质的分解能力有所不同，这一特点对菌株的分类鉴定起到很大的推动和促进作用。

由表2可知，Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6甲基红试验结果均为阴性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6纤维素试验均为阴性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6过氧化氢试验结果均为阳性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6菌膜生成试验结果均为阴性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6产氨试验结果均为阴性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6七叶苷试验结果均为阴性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6苯丙氨酸脱氢酶试验结果均为阴性；Zn2、Zn3、Zn5、Zn6淀粉水解试验结果均为阳性；Zn2油脂水解试验结果为阴性；Zn1、Zn4吲哚试验结果均为阴性；Zn3、Zn5、Zn6能够利用柠檬酸盐试验结果均为阳性；Zn1、Zn4明胶试验结果均为阳性；Zn1、Zn4硫化氢试验结果均为阴性；Zn1、Zn4 V.P.试验结果均为阴性；Zn2尿素试验结果均为阴性；Zn2卵磷脂试验结果均为阳性。

2.4 菌株的分子生物学鉴定

2.4.1 菌株DNA的提取、扩增与克隆

提取6菌株的DNA，采用1%凝胶电泳对其检测，电泳图谱如图2。DNA条带亮度和纯度较好，其片段大小约为1.5 kp，文中采用的DNA提取方法能够保证获得纯度较高的基因组DNA。

以筛选出菌株的DNA作为模板，利用引物BSF8/20和BSR1541/20对其PCR进行扩增后，采用1%凝胶电泳扩增结果进行检测(图3)。扩增效果良好，条带亮度好，纯度高，无非特异性的条带出现，其片段大小约为1 500 bp。

表2 6菌株生理生化试验结果

注：-表示阴性反应；+表示阳性反应。

图2 Zn基因组DNA电泳图谱

图3 Zn DNA的PCR扩增产物

利用已被克隆的菌株DNA作为模板，利用引物RV-M和M13-47对菌落PCR进行扩增后，采用1%凝胶电泳对扩增结果进行检测(图4)。扩增效果良好，条带亮度好，纯度高，无非特异性条带的出现，其片段大小约为1 500 bp。

2.4.2 菌株的16SrDNA序列分析

将16SrDNA的测序结果经Vecscreen去载体后，将所测得的序列与Genbank中核酸数据库中已有的16SrDNA进行BLAST比对(表3)。比对结果表明，6菌株16SrDNA序列比对结果与Genbank数据库中已知的细菌16SrDNA序列相似性为97%～100%，相似性均高于97%。

图4 Zn菌落PCR扩增产物

菌株编号最相近的种属名称Genbank分类号相似度/%Zn1StenotrophomonasKF059267.199Zn2Xanthomonassp.FJ600362.197Zn3Enterobactercloacaesubsp.CP003737.197Zn4UnculturedstenotrophomonasspFJ193149.198Zn5Enterobactersp.JQ231212.197Zn6Enterobactersp.HQ289883.197

3 结束语

从Zn质量分数为800 mg·kg-1的长药景天生活的根际土壤中进行菌株分离、筛选、鉴定，从中获得6个菌株。Zn1和Zn4均属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，相似度分别达到99%和98%。Zn2与黄色单胞菌属(Xanthomonas)的相似度达到97%。Zn3、Zn5和Zn6与肠杆菌属(Enterobacter)的相似度均为97%。

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王莹，女，1983年3月生，东北林业大学林学院，博士研究生；现工作于哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，讲师。E-mail：67240473@qq.com。

王竞红，东北林业大学园林学院，副教授。E-mail：yuanlin@nefu.edu.cn 。

2016年11月24日。

Q93-331

责任编辑：任 俐。

Separation, Screenin and Identification ofHylotelephiumspectabileStrains Resisted Zn in Rhizosphere Soil//Wang Ying, Wang Jinghong(Northeast Forestry University, Harbin 150000, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(3)：86-89.

Rhizosphere soil samples were collected from plants ofHylotelephiumspectabilewhich grew well in a pot experiment with Zn concentration of 800 mg·kg-1. After enrichment culture and separation strains which resisted Zn, six bacterial strains (Zn1, Zn2, Zn3, Zn4, Zn5 and Zn6) were screened. By morphological observation, physiological and biochemical experiments and molecular biology experiments, Zn1 and Zn4 were identified as Stenotrophomonas with the similarities of 99% and 98%, respectively, and Zn2 was identified asXanthomonaswith the similarity of 97%, and Zn3, Zn5 and Zn6 were identified as Enterobacter with the similarity of 97%.