基于3，5-二硝基水杨酸比色法建立一种快速测定总糖含量的方法

任 婧，李景富，张 佳，刘俊芳，许向阳，姜景彬

(东北农业大学 园艺园林学院，哈尔滨 150036)



基于3，5-二硝基水杨酸比色法建立一种快速测定总糖含量的方法

任 婧，李景富，张 佳，刘俊芳，许向阳，姜景彬

(东北农业大学 园艺园林学院，哈尔滨 150036)

本实验利用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法对番茄果实总糖含量进行了测定，并初步建立了微型化DNS比色法测定总糖含量的实验方法和DNS比色法测定番茄总糖含量的最佳条件，对影响测定结果的因素：测定波长、显色剂用量、显色时间进行了单因素试验。结果表明，540 nm波长、0.2 mL DNS、沸水浴4 min为最佳测定条件。该最佳测定条件下，葡萄糖含量在20～200 μg与吸光值呈良好的线性关系。利用得到优化方法对4个番茄品种的总糖含量进行了测定，结果表明测定样品在1.5 h内的吸光值较为稳定，RSD为2.19%～2.88%。本研究得到番茄果实总糖含量测定的优化方法，是一种稳定、高效可行的测定方法，为番茄高糖品种的鉴定和筛选提供了依据。

番茄；DNS；酶标仪

番茄(Lycopersicon esculentum Mill)，原产于南美洲的秘鲁和墨西哥，营养丰富，是人们餐桌上不可缺少的蔬菜。番茄也是全世界种植最为普遍的蔬菜作物之一。番茄含有VA、VC、叶酸、钾等主要的营养元素，其中富含的番茄红素可以清除人体内的活性氧自由基，延缓衰老，同时具有预防癌症、心血管疾病等功能[1]。因此，近些年番茄果实的风味品质和营养含量也越来越受到人们的关注[2]。含糖量是番茄风味品质的重要组成部分[3]，同时也是番茄品质育种的重要指标。而番茄含糖量的测定的方法较多，如高效液相色谱法[4]、斐林试剂法[5]、蒽酮比色法[6]、3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法[7]等，大多是利用紫外可见光吸收法，但这些方法存在一些明显的缺点，如价格昂贵、操作复杂、测定时间长、污染严重，不能进行批量测定。DNS比色法是半微量测定糖法[8]，操作简便、快速，适合批量测定。本实验对3，5-二硝基水杨酸法测定番茄总糖含量的反应条件进行了优化，寻找最佳实验条件以保证试验的精确度，获得可靠的实验数据为番茄育种提供参考。

1 仪器与试药

酶标仪(伯腾Epoch)；水浴锅；天平；容量瓶；离心管；3，5-二硝基水杨酸；6 mol/L HCl；6 mol/L NaOH；0.5%酚酞；葡萄糖；蒸馏水。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 DNS 试液的配制

将6.3 gDNS和2 mol/LNaOH溶液362 mL，加到500 mL含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1 000 mL，贮于棕色瓶中备用[9]。

2.1.2 葡萄糖标准液的配制

精密称定葡萄糖1 g，加水溶解并定容至1 000 mL 的容量瓶，即得浓度为1 mg/mL。

2.1.3 待测总糖溶液的制备

将-80℃冷冻的番茄“16588”、“16698”、“16541”、“16513”去皮、籽，取3 g，充分研磨成匀浆，放入离心管，加入6 mol/L盐酸10 mL和蒸馏水15 mL，沸水浴40 min，过滤，冷却后滴入1滴酚酞，用6 mol/L NaOH中和至pH中性，定容至100 mL。

2.2 优化实验

为建立一种快速、准确测定还原糖的含量的方法，对3，5-二硝基水杨酸比色法的测定波长、显色剂用量、显色时间进行单因素试验。

2.2.1 最佳波长

取葡萄糖标准液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180 μL、200 μL到0～10号离心管中，加蒸馏水至200 μL，DNS 0.4 mL于离心管中混合，沸水浴5 min，立即冰水冷却，静置10 min，加入1 600 μL水混匀，摇匀后以酶标板空白孔为空白对照，在300～800 nm波长下测定吸光值。以波长值为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线。在300～460 nm波长内各浓度不都有对应吸光值，550～800 nm波长内空白对照的值为负值，均不考虑(图1)。470～540 nm波长内对应的标准曲线的相关系数在540 nm处最大(R2=0.9757y=0.003x-0.0194)，故选择540 nm为最佳波长。

2.2.2 显色剂用量

取葡萄糖标准液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180 μL、200 μL到0～10号离心管中，加蒸馏水至200μL，分别加入DNS 0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于离心管中混合，沸水浴5 min，立即冰水冷却，静置10 min，加入1 600 μL水混匀，以0号管为空白对照，在540 nm波长下测定吸光值，每组进行3次重复。以葡萄糖含量为横坐标，吸光值(A540)为横坐标绘制标准曲线。在0.2 mL DNS加入量时标准曲线的相关系数(R2=0.996 1)最大(图2)，故选择0.2 mL为DNS最适加入量。

图1 不同浓度葡萄糖在不同波长下的吸光值Fig.1 The absorbance of different concentrations of glucose at different wavelengths

图2 不同浓度DNSFig.2 Different concentrations of DNS

2.2.3 显色时间

取葡萄糖标准液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180 μL、200μl到0～10号离心管中，加蒸馏水至200 μL，加入DNS 0.2 mL于离心管中混合，分别沸水浴1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，立即冰水冷却，静置10 min，加入1 600 μL水混匀，以0号管为空白对照，在540 nm波长下测定吸光值，每组进行3次重复。以葡萄糖含量为横坐标，吸光值(A540)为纵坐标绘制标准曲线，4 min时标准曲线的相关系数(R2=0.997 5)最大(图3)，故选择4 min为最适加热时间。

2.3 标准曲线绘制

取葡萄糖标准液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL、140 μL、160 μL、180μL、200 μL到0～10号离心管中，加蒸馏水至200 μL，加入DNS 0.2 mL于离心管中混合，沸水浴4 min，立即冰水冷却，静置10 min，加入1 600 μL水混匀，以葡糖糖含量为横坐标，吸光值(A540)为纵坐标，绘制标准曲线。

图3 不同加热时间Fig.3 Different heating times

图4 标准曲线Fig.4 The standard curve

2.4 精密度试验

将不同浓度的葡萄糖标准液(20 μL、100 μL、200 μL)，按上述方法显色，加到同一个酶标板上测定吸光值，随后分别加到3个不同的酶标板上测量吸光值。同样处理进行第二批次，不同酶标板在540 nm处的吸光值相对标准偏差在0.86%～3.07%(表1)，表明仪器的精密性良好，可用于测定吸光值。

表1 精度测定值

2.5 番茄总糖含量的测定

2.5.1 总糖含量测定

取测定液200 μL稀释到600 μL，取稀释后的溶液200 μL加入DNS 0.2 mL到离心管，沸水浴4 min，立即冰水冷却，加入蒸馏水1 600 μL，静置10 min，使用酶标仪测定吸光值，同时按2.3方法绘制标准曲线。计算得到“16698”、“16588”、“16541”、“16513”总糖含量分别为42.06 mg/g、54.38 mg/g、57.36 mg/g、49.41 mg/g。

2.5.2 稳定性试验

精密量取稀释待测液200 μL，按2.5.1项下方法显色，室温放置，每隔 30 min测定一次吸光度。结果表明，在显色 1.5 h 内基本稳定，RSD为2.19%～2.88%。

2.5.3 回收率试验

精密称取已知含量的总糖溶液各5份，分别精密加入葡萄糖对照品20 μg，按照2.5.1与2.3项方法分别测定其吸光值，代入标准曲线方程，计算回收率。结果(表2)表明测定结果可靠性良好，该方法可用于测定番茄总糖含量。

表2 回收率测定

3 讨论

DNS比色法测定总糖含量的原理是利用酸水解法将没有还原性的双糖和多糖使其降解成有还原性的单糖进行测定，还原糖在碱性条件下被氧化成糖酸及其他产物，3，5-二硝基水杨酸被还原为棕色3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内，还原糖含量与棕色物质颜色的深浅成正比关系，利用酶标仪测定其吸光值，带入标准曲线计算总糖含量。测定的关键步骤有测定波长的选择、显色液用量、显色时间、稳定时间等。

DNS比法测定还原糖含量最佳吸收光谱的确定，不同的作物需要采用不同的检测波长。朱海霞等[10]在马铃薯还原糖测定确定λmax=510 nm、赵凯等[11]在测定还原糖含量的研究确定λmax=550 nm、王俊丽等[12]对DNS法测定最佳波长的研究中确定λmax=520 nm，这些与本实验得出的λmax=470 nm 有所不同。这可能由于最佳波长的确定受到仪器灵敏度、试验中葡萄糖含量及DNS用量、蒸馏水加入量等因素的影响。因此应采用合适的实验反应体系和测定仪器来确定所需的最佳条件。本实验根据单因素试验得到在470 nm波长处不同含量的葡萄糖标准液(20～200 μg)均能测到吸光值且为最大值，但标准曲线在此波长下的线性较差，相关系数较低，可能与DNS显色液自身在此波长下也有极高的吸光值有关，这种自身吸光值高可能会对样品测定值产生误差，所以还原糖显色后具有最大吸光值的波长不一定是最佳测定波长。在540 nm波长处显色液自身吸光值最低且大于零，标准曲线相关性最好，综合相关系数和显色液自身吸光值，选定540 nm为最适测定波长。

实验使用酶标仪测定吸光值，酶标仪和分光光度计原理基本相似，对样品的吸光值可以进行批量测定，同时操作方便，减少了传统紫外分光光度计比色皿清洗不彻底从而影响测定值的问题。酶标法的线性范围良好，稳定性、可重复性和精密度较高，测定时需要的样品量少[13]。本实验根据单因素试验和RSM分析最终确定了最佳测定波长为540 nm，显色剂用量为0.2 mL，显色时间为4 min，稳定静置最少时间为10 min。根据最佳条件测定的番茄总糖糖含量在1.5 h内吸光值稳定，该方法可用于批量集中测定番茄总糖含量。番茄总糖的测定受到多种因素的干扰，如：水解时间、水解温度、HCl的加入量、番茄红素等。为了排除番茄糖液提取过程中色素对测定的干扰，试用活性炭除色素，以对照品溶液试验时，吸光值略有增加，说明活性炭吸附了色素等可以影响到吸光值测定的因素，与江建丽[14]测定五味子还原糖含量使用活性炭的结果不同，可能是由于测定样品不同，提取方法不同造成。从2.5.2 测定结果可以看出，不同品种番茄的测定值较为稳定、可靠，具有方便快捷、安全、准确、低成本等特点，可用于不同品种番茄总糖含量测定。

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A method for rapid determination of total sugar content based on 3, 5-dinitrosalicylic acid colorimetry

REN Jing, LI Jing-fu, ZHANG Jia, LIU Jun-fang, XU Xiang-yang, JIANG Jing-bin

(Northeast Agricultural University, College of Horticulture and Landscape, Harbin 150036, China)

In this study, a colorimetric method was used to estimate the total sugars content in tomato with 3, 5-dinitrosalicylic acid. An experimental method for the determination of total sugar content by miniaturiza DNS colorimetric method were initially established and we obtained the optimize conditions for the determination of total sugar content in tomato by DNS colorimetric method. The single-factor test and response surface methodology were applied to optimize conditions including the determination wavelength, color developer amount, time and stability of the reaction. The results showed that 540 nm wavelength, 0.2 mL, DNS and boiling water bath 4min were the best conditions for determination. There was a linear relationship between the content of glucose in the range of 20～200 μg and absorbance at this optimum determination conditions. The optimized method was used to determine the total sugar content of 4 tomato cultivars. The results showed that the properties of the samples were stable in 1.5 hour, and RSD was 2.19% to 2.88%. In this study, the optimal method for the determination of total sugar content in tomato fruit is a stable, efficient and feasible method which provided basis for identification and screening of high sugar cultivars.

Tomato; DNS; Microplate reader

2017-04-09

番茄杂种优势利用技术与强优势杂交种创制(2016YFD0101703)

任婧(1992-)，女，硕士。

李景富(1943-)，男，教授，博士研究生导师，e-mail：Lijf_2005@126.com。

TS255.7

A

1674-8646(2017)10-0066-04