禽致病性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2 EivC点突变的构建及其ATPase活性分析

许 漩，王少辉，刘 新，王 栋，梁 华，黄彩兰，吴晓君，丁 铲，王桂军，于圣青

（1. 安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

·研究论文·

禽致病性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2 EivC点突变的构建及其ATPase活性分析

许 漩1,2，王少辉2，刘 新2，王 栋2，梁 华2，黄彩兰2，吴晓君2，丁 铲2，王桂军1，于圣青2

（1. 安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

为了分析禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli, APEC）Ⅲ型分泌系统2（E. coli Type Ⅲ secretion system 2, ETT2）EivC ATPase关键活性位点，本研究通过比对分析病原菌ATPase序列，筛选APEC ETT2 EivC的关键位点。然后设计点突变引物，通过PCR方法构建EivC点突变片段，构建EivC点突变重组表达质粒。经IPTG诱导表达后纯化相应蛋白，并检测其ATPase活性。结果显示，EivC蛋白包含F0F1 ATPase的保守序列，且具有ATPase活性。测序结果显示EivC第175、199、201、233位氨基酸突变成功，融合蛋白获得成功表达与纯化。然而，点突变与野生型EivC的ATPase活性差异不具有显著统计学意义。本研究结果表明第175、199、201、233位氨基酸不影响EivC的ATPase活性。

禽致病性大肠杆菌；Ⅲ型分泌系统2；eivC基因；ATPase

细菌的分泌系统能将蛋白质转运到细菌表面，或释放至细菌外环境中，或直接注入宿主细胞内，其与细菌的生存及致病性密切相关。Ⅲ型分泌系统（Type Ⅲ secretion system, T3SS）存在于致病性大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、耶尔森菌等种属中，与毒力因子的分泌及毒力有关[1,2]。T3SS是已知的最复杂分泌系统，由20种以上高度保守的蛋白组成一个针状复合体。ATPase是T3SS中高度保守的核心组分，其主要通过水解ATP为T3SS提供能量[3]。另外，研究表明ATPase还可以识别效应蛋白，参与效应器蛋白与分子伴侣解离过程。目前，动物和植物病原菌的T3SS ATPase，包括大肠杆菌EscN[4]、沙门菌InvC[5,6]、SsaN[7]、FliI[8]、耶尔森氏菌YsaN[9]、黄单胞菌HrcN[10]和肺炎衣原体CdsN[11]的分子功能及关键活性位点均已阐明。

APEC可感染各种禽类引起禽大肠杆菌病，由于APEC复杂的血清型及广泛的耐药性，并随着传播过程中基因组及质粒基因的水平转移，对其防治变得越来越艰难，严重制约了养禽业的发展。经前期研究发现E. coli Type Ⅲ secretion system 2（ETT2）在APEC中的分布率及突变亚型显著高于尿道致病性大肠杆菌（uropathogenic Escherichia coli，UPEC）和新生儿脑膜炎大肠杆菌（neomatal meningritis uropathogenic Escherichia coli，NMEC），其具有潜在的危害[12]。此外发现ETT2 核心组分EivC具有ATPase活性，在APEC感染过程中发挥重要作用[13]，然而EivC的关键酶活位点尚不清楚。因此，本研究通过构建点突变EivC蛋白，并检测其ATPase活性，为研究EivC的酶活关键位点及其功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒 禽致病性大肠杆菌APCE94由本实验室保存，经鉴定为O78血清型，对鸡、鸭具有致病性[12,13]。大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。原核表达载体pET28a由本实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器 质粒提取试剂盒购自天根（北京）生化科技有限公司；胶回收试剂盒购自赛默飞世尔科技（上海）有限公司；2×PrimerSTAR Mix、DNA Ligation Mix、限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA Marker购自北京康为世纪生物科技有限公司；His标签蛋白纯化磁珠购自Selleck生物科技有限公司；ATPase/GTPase Activity Assay Kit购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；PCR仪器购自ABI公司；蛋白电泳仪购自Bio-Rad公司；高压破碎仪购自永联生物科技（上海）有限公司。

1.3 序列分析 根据ETT2毒力岛序列[12]，PCR扩增获得APCE94菌株ETT2 eivC基因序列，并通过NCBI BLAST在线软件比对分析EivC的蛋白序列。经分析eivC基因编码F0F1 ATPase，因此利用DNAStar软件对病原菌的ATPase蛋白序列进行分析，并绘制系统进化树。

1.4 引物设计 根据APCE94菌株eivC基因序列，设计eivC基因表达引物及点突变引物（表1），由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 重组表达载体的构建 以APCE94菌株DNA为模板，利用原核表达引物EivC表达F/R扩增eivC基因，经过BamH I/Hind Ⅲ双酶切后连接到pET28a质粒，构建原核表达质粒pET28a-eivC。以pET28aeivC为模板，使用引物EivC表达F/pet28-eivC点175突变R、pet28-EivC点175突变-F/EivC表达R分段扩增后，再用引物EivC表达F/R将片段进行overlap PCR，构建eivC 175位点突变片段，其他位点突变方法同理。将突变的片段经BamH I/Hind Ⅲ双酶切后连接到pET28a质粒，分别命名为 pET28a-EivCK175E、pET28a-EivC-R199G/R201H、pET28a-EivC-R233H。野生型及点突变重组表达质粒经PCR鉴定正确后送英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。

1.6 融合蛋白的表达与纯化 将测序正确的阳性重组表达质粒热激转化入表达菌BL21（DE3），涂布含Kan抗性LB平板培养过夜，挑取单菌落经PCR鉴定，将阳性菌分别命名为BL21-pET28a-EivC、BL21-pET28a-EivC-K175E、BL21-pET28a-EivCR199G/R201H、BL21-pET28a-EivC-R233H。将重组表达表达菌经IPTG（终浓度为1 mmol/L）低温低速诱导培养18 h，离心收集菌体，用PBS清洗3次后进行高压破碎。根据His标签蛋白纯化的Nickel磁珠说明书纯化重组蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度。

1.7 ATP酶活性测定 根据ATPase/GTPase Activity Assay Kit说明书，测定EivC的ATPase活性，具体方法通过测定ATPase水解底物产生的无机磷酸盐（Pi）含量来判断ATPase的活性。

2 结果

2.1 EivC序列分析 对APCE94的ETT2 EivC蛋白序列分析结果表明，EivC蛋白包含F0F1 ATPase的保守序列Walker Box A、Walker Box B及DCCD Box，因此EivC可能为ATPase（图1A）。进化树分析显示，EivC基因与沙门菌的ATPase InvC的同源性最高，与志贺氏菌中Spa47同源性也较高，属于同一个分支（图1B）。

2.2 重组表达载体的构建与鉴定 前期研究表明，沙门菌InvC的164位甘氨酸（Gly）、165位赖氨酸（Lys）、189位精氨酸突变（Arg）、191位精氨酸（Arg）和233位精氨酸（Arg）是ATPase活性的关键位点[6]。进化树分析表明，EivC与沙门菌的ATPase InvC的同源性最高。因此根据序列比对，本研究选择EivC蛋白第175位赖氨酸（Lys）、第199位精氨酸（Arg）、第201位精氨酸（Arg）、第233位精氨酸（Arg）进行定点突变（图1C）。PCR扩增目的片段后，酶切连接至原核表达载体pET28a，进行PCR鉴定（图2A），挑取阳性单克隆进行测序，结果显示点突变均正确（图2B）。

2.3 融合蛋白的表达与纯化 将鉴定正确的重组表达质粒转化入BL21（DE3）进行诱导表达，结果显示BL21-pET28a-EivC、BL21-pET28a-EivC-K175E、BL21-pET28a-EivC-R199G/R201H、BL21-pET28a-EivC-R233H均表达了大小约为50 kDa的融合蛋白，与预期大小一致（图3A）。纯化后的融合蛋白SDS-PAGE结果见图3B，表明所有融合蛋白为可溶性蛋白。用BCA法测定纯化后融合蛋白EivC、EivC-K175E、EivC-R199G/R201H、EivC-R233H浓度分别为0.39、0.3、0.348、0.316 mg/mL。

2.4 酶活测定 酶活试剂盒检测结果显示，His-EivC融合蛋白具有ATPase活性，磷酸盐释放速率为（0.28±0.08） mmol/(min.mg)，与其他病原菌T3SS ATPase的水解速率类似[13]。为了确定点突变对EivC ATPase酶活性的影响，将纯化后含有点突变位点的融合蛋白His-EivC进行水解ATP能力检测，结果显示点突变与野生型EivC的ATPase活性差异不具有显著统计学意义（P>0.05），具体见图4。

3 讨论

细菌在长期进化过程中利用T3SS分泌蛋白作用于特定的宿主细胞，引起宿主细胞的特异性或非特异性免疫应答。研究人员分析EHEC O157:H7基因组序列时发现了与沙门菌T3SS毒力岛SPI-1类似的29.9 kb毒力岛ETT2，其存在于大多数大肠杆菌[14]。我们发现ETT2在APEC和肠致病性大肠杆菌中的分布率相似，其显著高于UPEC和NMEC。由于APEC与UPEC和NMEC均属于肠道外致病性大肠杆菌，具有许多相同的毒力因子和相似的致病机制，因此APEC具有重要的公共卫生学意义。

图1 ATP酶EivC序列分析Fig.1 Sequence analysis of ATPase EivCA: EivC蛋白序列分析; B: ATPase进化树分析; C: ATPase关键活性位点分析A: EivC protein sequence analysis; B: Evolutionary tree analysis; C: Analysis of key active sites of ATPase

图2 重组表达质粒的PCR鉴定及测序结果Fig.2 Identif cation of recombinant plasmid by PCR and the results of sequencingA: 重组表达质粒的PCR鉴定; B: 重组质粒的测序鉴定. M: DNA分子量标准(DL2000); 1: pET28a-EivC; 2: pET28a-EivC-K175E; 3: pET28a-EivC-R199G/R201H; 4: pET28a-EivC-R233HA: Identif cation of recombinant plasmid by PCR; B: Identif cation of recombinant plasmid by sequencing. M: DNA Marker(DL2000); 1: pET28a-EivC; 2: pET28a-EivC-K175E; 3: pET28a-EivC-R199G/R201H; 4: pET28a-EivC-R233H

图3 纯化前后的融合蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of fusion protein and purif ed fusion protein.A: 融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析; B: 纯化的融合蛋白SDS-PAGE电泳分析. M: 蛋白分子量标准; 1:阴性对照; 2: BL21-pET28a-EivC; 3: BL21-pET28a-EivC-K175E; 4: BL21-pET28a-EivC-R199G/R201H; 5: BL21-pET28a-EivC-R233HA: SDS-PAGE analysis of fusion expression; B: SDS-PAGE analysis of purf ed fusion protein. M: Protein Marker; 1: Negative control; 2: BL21-pET28a-EivC; 3: BL21-pET28a-EivC-K175E; 4: BL21-pET28a-EivC-R199G/R201H; 5: BL21-pET28a-EivC-R233H

图4 ATP酶活性检测Fig.4 ATPase activity test

ATP酶蛋白是所有T3SS中高度保守的组分，是T3SS发挥作用的关键，被认为为分泌过程提供能量[3]。T3SS ATPase主要参与细菌鞭毛的形成并对具有相关毒力的效应蛋白进行输出。已经鉴定了来自动物和植物病原菌的几种T3SS ATP酶，包括大肠杆菌EscN[4]，沙门菌InvC[5,6]、SsaN[7]、FliI[8]，耶尔森氏菌YscN[9]、黄单胞菌HrcN[10]和肺炎衣原体CdsN[11]，他们与F0F1 ATP酶的催化性β亚基的氨基酸序列有高度同源性，并且能够水解ATP[19]。先前有研究表明，T3SS ATPase的ATP水解是效应蛋白与其同源分子伴侣解离所必需的。此外，已有研究表明ATPase参与效应蛋白在其分泌之前的解折叠[15-18]。

F0F1 ATPase是细菌中普遍存在的转运发动机，在细菌细胞膜、叶绿体、线粒体以及内皮细胞、肿瘤细胞质膜上利用电化学跨膜转运合成ATP。在对APCE94的ETT2 eivC基因及其蛋白序列分析后发现与其他T3SS ATPase 类似，EivC与F0F1 ATPase的β亚基同源，且包含F0F1 ATPase的保守序列Walker Box A、Walker Box B及DCCD Box[19]，因此EivC可能为ATPase。在之前的研究中，纯化的His-EivC融合蛋白显示有ATPase活性，P释放速率为0.28±0.08 mmol/min/mg，这种ATP水解速率类似于其他T3SS ATP酶家族成员，如InvC、EscN、SsaN、FliI、YsaN、HrcN和CdsN的水解速率。此外，我们还确定了ETT2 ATPase EivC是APEC中必不可少毒力因子，在APEC感染过程中发挥重要作用。将APEC94中的eivC基因缺失，会导致细菌毒力减弱，在HD-11细胞中存活量减少，在实验动物体内定植量减少，而在eivC基因互补后毒力有所回复[13]。

研究表明，F0F1 ATPase 活性受具有不同分子量的β亚基上的外部链接调节。将F0F1 ATP酶中128位丙氨酸（Gla）突变为天冬氨酸（Asp）能消除其β亚基的二聚化，从而影响酶活性[20]。另外，沙门菌SPI-2中ATPase SsaN的活性依赖于其中位于192的精氨酸[7]。沙门菌SPI-1中ATPase InvC通过诱变分析发现，164位甘氨酸（Gly）突变为半胱氨酸（Cys）、165位赖氨酸（Lys）突变为谷氨酸（Glu）、189位精氨酸突变（Arg）突变为甘氨酸（Gly）、191位精氨酸（Arg）突变为组氨酸（His）、233位精氨酸（Arg）突变为组氨酸（His）这5个位点的突变会使InvC水解ATP能力下降[6]。根据进化树分析，EivC与沙门菌的ATPase InvC的同源性最高。然而EivC的关键酶活位点尚不清楚，故在本研究中预测了4个可能是APCE94 EivC酶活的关键位点并进行突变，分别是175位赖氨酸（Lys）突变为谷氨酸（Glu）、199位精氨酸（Arg）突变为甘氨酸（Gly）/201位精氨酸（Arg）突变为组氨酸（His）、233位精氨酸（Arg）突变为组氨酸（His），并检测其ATPase活性。实验结果表明，这4个位点的突变并不会影响EivC的酶活性，说明这4个位点并不是决定EivC酶活性的关键位点，这为进一步研究EivC的酶活关键位点及其功能提供参考。

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CONSTRUCTION OF EIVC POINT MUTATION AND ANALYSIS OF ITS ATPASE ACTIVITY IN AVIAN PATHOGRNIC ESCHERICHIA COLI TYPE ⅢSECRETION SYSTEM 2

XU Xuan1,2, WANG Shao-hui2, LIU Xin2, WANG Dong2, LIANG Hua2, HUANG Cai-lan2, WU Xiao-jun2, DING Chan2, WANG Gui-jun1, YU Sheng-qing2

(1. College of Animal and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

To determine the catalytic sites of TypeⅢ secretion system 2 (ETT2) ATPase EivC in Avian pathogenic Escherichia coli (APEC), we screened the key points of APEC ETT2 EivC by comparing the ATPase sequences of other pathogenic bacteria. The sitedirected mutagenesis primers were designed and mutant recombinant plasmids were constructed using PCR method. The fusion protein was expressed with induction of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Then, the ATPase activity of the fusion protein was determined using an ATPase/GTPase assay kit. The results indicated that EivC contained conserved region F0F1 ATPase and possessed ATPase activity. The DNA sequencing showed that the mutations at 175, 199, 201 and 233 amino acids of EivC were constructed. However, there was no significant difference in the ATPase activity between the recombinant mutant and wild-type EivC proteins, suggesting that 175, 199, 201 and 233 amino acids did not affect ATPase activity of EivC.

Avian pathogenic Escherichia coli; Type Ⅲ secretion system 2; eivC gene; ATPase

S852.612

A

1674-6422（2017）03-0047-07

2017-02-06

国家自然科学基金项目(No. 31572523)；公益性农业（科研）专项项目（No. 201303044）

许漩，女，硕士研究生，预防兽医学专业

于圣青，E-mail: yus@shvri.ac.cn；王桂军，E-mail：704578081@qq.com