三源重组H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

汪 琪，刘晓敏，杨海明，王帅勇，单同领，童 武，李国新，童光志，于 海

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

·研究论文·

三源重组H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

汪 琪，刘晓敏，杨海明，王帅勇，单同领，童 武，李国新，童光志，于 海

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

利用RT-PCR技术扩增三源重组H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Tianjin/10/2013（H1N1）的8个基因片段，分别克隆至双向转录/表达载体pBD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞，收取转染48 h后的细胞上清并接种MDCK细胞，成功拯救出有血凝活性的病毒。全基因序列测定结果表明，拯救病毒与野生病毒的核苷酸序列完全一致。生长曲线的测定结果表明，不同时间点野生毒株与拯救毒株在MDCK细胞上的病毒滴度没有明显差异。三源重组H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立为进一步开展猪流感病毒的生物学特性研究奠定了基础，同时也为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。

猪流感病毒；H1N1；反向遗传操作技术；病毒拯救

猪流感（swine influenza，SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起的一种猪的急性、热性和高度接触性呼吸道传染病，临床症状主要表现为咳嗽、喷嚏、高热、呼吸困难、体重减轻等[1]。该病一年四季都可发生，但以春秋多发。病猪和带毒猪是SIV主要的传染源。SI作为规模化养猪场中普遍存在且难以根除的疾病，不仅使仔猪的致死率升高，而且引起母猪的生殖障碍[2]。更为严重的是，SIV常与其他细菌和病毒混合感染，给养猪业造成了巨大的经济损失。

SIV属于正黏病毒科、A型流感病毒属，为单股负链分节段的RNA病毒，基因组包括8个独立的片段。目前已发现的SIV包括H1N1、H1N2、H1N7[3]、H3N2、H5N1、H9N2等多种血清亚型。其中，H1N1亚型是占主要地位的亚型之一。1930年，美国学者Shope等[4]在北美的猪群中分离到第1株SIV, 即古典H1N1 SIV。此后，H1N1亚型SIV在世界范围内的猪群中被持续分离到。1979年，在欧洲猪群中分离到1株H1N1病毒，该病毒的8个基因都是禽源的，命名为欧洲类禽H1N1 SIV，其在欧洲猪群中广泛流行[5]。本实验室于2013年从天津地区分离到3株三源重组H1N1亚型SIV，其中1株代表毒株命名为A/Swine/Tianjin/10/2013（H1N1）。遗传演化分析结果表明，该病毒PB2、PB1、PA和NP基因来源于2009年甲型H1N1流感病毒，NS片段来源于三源重组SIV，HA、NA和M基因来源于欧洲类禽H1N1 SIV[6]。近年来在猪群中大量地分离到三源重组病毒，似乎表明流感病毒在猪群中的活动日趋复杂，应予以足够重视。

反向遗传操作技术是一种新的分子生物学技术，是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行直接加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失等，从而获得有感染性的病毒，以此来进行病毒的调控机制、致病性及宿主适应性等研究[7-10]。本研究建立三源重组H1N1亚型SIV反向遗传操作系统，并拯救出能够在动物传代细胞中复制的病毒，为三源重组H1N1亚型SIV的分子致病机理及新型SI疫苗的研制奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 毒株与载体 三源重组H1N1亚型猪流感病毒A/ Swine/Tianjin/10/2013（H1N1）（简称TJ10）由本实验室分离保存；8质粒流感病毒拯救系统双向表达载体pBD由中国农业科学院上海兽医研究所李泽君研究员提供。

1.2 菌种和细胞 E.coli DH5α感受态细胞购自北京天根生物有限公司；293T细胞与MDCK细胞由本实验室保存。

1.3 主要试剂 RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit、质粒提取试剂盒QIAprep Spin Miniprep Kit均购自QIAGEN公司；高保真酶Pfu Ultra Ⅱ Fusion HS DNA Polymerase 购自Agilent 公司；dNTP、DL2000 DNA Marker均购自TaKaRa大连宝生物工程公司；Gel Extraction Kit购自Omega Bio-Tek公司；DNA PolymeraseⅠLarge（Klenow）Fragment、BspQ I限制性内切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自NEB公司；反转录试剂盒SuperScript III Frist-Strand Synthesis System for RT-PCR、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、OPTI-MEM培养基、质体、TPCK-trypsin、Lipofectamine 2000均购自Invitrogen公司；公牛血清白蛋白（BSA）购自Promega公司。

1.4 引物设计 对GenBank中公布的H1N1亚型流感病毒5'和3'末端保守序列进行比对，并参照文献[11]，利用Oligo6.0 软件设计合成扩增流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M 和NS基因的引物（见表1）及流感病毒反转录通用引物Uni-12，引物由Invitrogen公司合成。

1.5 病毒RNA提取及目的片段扩增 将病毒在MDCK细胞中增殖后，按照QIAGEN RNeasy Mini Kit说明书分离提取病毒RNA，然后根据Invitrogen SuperScript III First-Strand说明书将提取的RNA反转录合成cDNA，以此cDNA为模板，用高保真酶PfuUltra Ⅱ Fusion Hs DNA Polymerase扩增病毒的8个基因片段。

1.6 重组质粒的构建、鉴定及纯化 将经过RT-PCR扩增的8个基因片段进行核酸电泳，切下分子量大小相符的条带进行胶回收。将pBD及纯化的PCR产物用BspQI酶切，酶切产物核酸电泳，切取目的条带进行胶回收。处理后的片段及载体分别在16℃连接仪内过夜连接。连接产物按照常规方法转化到E.coli DH5α感受态细胞中，取适量菌液涂布于含有氨苄青霉素（50 μg/mL）LB平板上，37℃培养12 h，挑取白色孤立菌落，接种于5 mL 含有氨苄青霉素（50 μg/mL）液体LB培养基，在37 ℃恒温振荡器内培养14~16 h。菌液PCR鉴定为阳性克隆，保存菌液并取适量样品送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。对于序列正确的菌液进行菌液扩增，按照QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒说明书提取质粒，并测其浓度。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.7 病毒的拯救 按每个质粒1μg计算，将8个质粒混合到1个EP管内，加入150μL无血清的Opti-MEM培养基，充分混匀。20 μL Lipofectamine 2000与150 μL无血清的Opti-MEM培养基充分混匀后作用5 min，然后加至混匀的质粒中，室温作用20 min。用无血清的Opti-MEM培养基将培养到最佳状态的293T细胞洗2遍后，把上述混合物加至293T细胞的六孔板中，轻轻混匀。37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，每孔加入1ml含8%BSA的无血清OPTIMEM，继续培养，54 h后收取上清。将收集到的上清经TPCK-trypsin处理，接种到MDCK细胞中，待细胞出现明显病变时，收集病毒。

1.8 拯救病毒的鉴定 收集的病毒上清进行血凝（Hemagglutination，HA）试验，测其血凝效价。同时将该细胞上清再次接种MDCK细胞，待细胞病变明显时，收集上清。利用此上清液，提取病毒总RNA，反转录合成cDNA后，以该cDNA为模板扩增拯救病毒的8个基因片段，并进行基因片段的序列测定。

1.9 生长曲线的绘制 以相同剂量分别接种到2块单层铺满MDCK细胞的12孔板中，接种后第12、24、36、48 h分别收集病毒，每个时间点每种病毒做3个重复，测定所有病毒的TCID50，利用GraphPad Prism 5软件绘制生长曲线。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增片段结果 提取原始野生毒株的RNA并反转录合成cDNA，以该cDNA为模板进行目的片段的扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳，获得相应大小的8个目的条带：NS、M、NA、NP、HA、PA、PB1、PB2，见图1。

图1 野生株8个基因片段RT-PCR扩增结果Fig.1 RT-PCR products of eight genes of wild strainM: DNA分子量标准(DL2000); 1: NS基因; 2: M基因; 3: NA基因; 4: NP 基因; 5: HA基因; 6: PA基因; 7: PB1基因; 8: PB2基因M: DNA Marker(DL2000); 1: NS gene; 2: M gene; 3: NA gene; 4: HA gene; 5: NP gene; 6: PA gene; 7: PB1 gene; 8: PB2 gene

2.2 重组pBD阳性质粒鉴定结果 8个基因片段与目的载体pBD连接后，按常规方法转化到大肠杆菌DH5α菌感受态细胞中，挑取孤立白色菌落进行菌液增殖后鉴定，菌液鉴定结果为阳性（见图2）的送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，测序结果与相应序列一致。

图2 重组pBD阳性质粒的鉴定Fig.2 Identif cation of recombinant pBD plasmidsA: pBD-NS; B: pBD-M; C: pBD-NA; D: pBD-NP; E: pBD-HA; F: pBD-PA; G: pBD-PB1; H: pBD-PB2. M: DNA分子量标准(DL2000); 1~3: 重组质粒A: pBD-NS; B: pBD-M; C: pBD-NA; D: pBD-NP; E: pBD-HA; F: pBD-PA; G: pBD-PB1; H: pBD-PB2. M: DNA Marker(DL2000); 1-3: Recombinant plasmids

2.3 拯救病毒的鉴定结果

2.3.1 血凝（HA）试验 收集接种了拯救病毒的MDCK细胞上清，进行血凝试验。MDCK细胞增殖1代后的血凝效价为23。将拯救出的病毒在MDCK细胞上接种至第2代，其血凝效价与原始毒株的血凝效价相同，均为26。

2.3.2 序列鉴定 提取拯救病毒的RNA，用RT-PCR分别扩增出病毒基因组的8个片段（见图3）。序列测定结果表明，拯救株与野生株病毒基因序列完全一致。由此进一步证明病毒拯救成功，拯救病毒命名为rTJ10。

图3 rTJ10 8个基因片段RT-PCR扩增结果Fig.3 RT-PCR products of eight genes of rTJ10M: DNA分子量标准(DL2000); 1: NS基因; 2: M基因; 3: NA基因; 4: NP基因; 5: HA基因; 6: PA基因; 7: PB1基因; 8: PB2基因M: DNA Marker(DL2000); 1: NS gene; 2: M gene; 3: NA gene; 4: NP gene; 5: HA gene; 6: PA gene; 7: PB1 gene; 8: PB2 gene

2.3.3 生长曲线的绘制 拯救毒株与野生毒株以同种剂量分别接种到单层铺满MDCK细胞的12孔板中，分别在接种后第12、24、36、48 h收集细胞上清，测定TCID50，利用GraphPad Prism 5软件绘制生长曲线。差异显著性分析结果显示，不同时间点，拯救株（rTJ10）与野生株（TJ10）在MDCK细胞上的病毒滴度差异不显著（见图4）。

图4 野生株与拯救株生长曲线的比较Fig.4 The growth curve of the wild-type and rescued strain

3 讨论

SI是养猪业中常见的呼吸道病和免疫抑制病，很大程度上是由于SIV常与猪2型链球菌、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒等其他细菌和病毒继发或混合感染，对养殖业危害极大[12,13]。因此，研究SI具有显而易见的兽医传染病学意义。更为重要的是，猪呼吸道上皮细胞同时存在禽流感病毒的受体唾液酸α-2,3-半乳糖苷（SAα2，3Gal）和人流感病毒的受体唾液酸α-2,6-半乳糖苷（SAα2，6Gal），猪成为禽、猪、人流感病毒共同的易感宿主，被认为是流感病毒基因重组或重排的“混合器”，也是产生引起人类流感大流行毒株的重要来源[14,15]。因此，SI的影响更在于深远的公共卫生学意义。

20世纪至今，人类经历过4次流感大流行。每次流感大流行都给人类带来了巨大的灾难，并且都可能与SI保持着千丝万缕的联系。1957年亚洲流感大流行和1968年中国香港地区流感大流行都是由当时人群中流行的流感病毒与禽流感病毒重组后的新病原引起的。2009年甲型H1N1病毒也是人、猪、禽流感病毒的三源重组病毒，其HA、NP和NS基因源自于古典H1N1 SIV，PB2、PA和PB1片段来源于三源重组SIV，NA和M片段来源于欧洲类禽H1N1 SIV。2005年~2009年间，美国陆续检测到11例人感染SIV的病例，病毒遗传分析表明其中10例由三源重组H1N1亚型SIV感染，1例由三源重组H1N2亚型SIV感染[16]。2009年，我国南方出现了古典H1N1、人源、禽源三源重组的H1N2亚型SIV[17]。Ma等[18]指出，这些新出现的三源重组病毒都由相同的内部基因构成，称之为“三源基因重组内部基因盒”（TRIG cassette），并认为拥有这种内部基因的SIV具有明显的选择优势。所有分离到的这些SIV再次证实了流感病毒在猪体内基因重组的理论，使SI的防控形势复杂化。因此应加强其致病机制的研究，反向遗传操作技术的发展和成熟为流感病毒的深入研究奠定了基础。

反向遗传操作技术是指对病毒基因组进行目的性修饰或改造，以对其进行功能和表型的分析[19]。流感病毒为负链RNA病毒，其病毒基因组无信使功能且无感染性，因而其拯救的难度较正链RNA/DNA病毒有所增加。从病毒RNA开始转录需要核糖核蛋白复合体（Ribonucleoprotein，RNP）的存在。流感病毒基在感染细胞的核内完成复制，因此必须在细胞核内同时含有8种功能性的RNPs[20]。获得RNA病毒的感染性分子克隆后，就可在DNA水平上通过突变、缺失、插入等手段来研究RNA病毒的基因复制和表达，RNA病毒与宿主的相互作用以及构建新的病毒载体等[21]。本研究成功构建三源重组H1N1亚型SIV的8质粒反向遗传操作平台，拯救出所有片段均来自于野生株的病毒，拯救株与野生株的在细胞上的生长特性基本保持一致，且具有良好的遗传稳定性。三源重组H1N1亚型SIV反向遗传操作平台的成功构建将为流感病毒的研究提供了有利的工具，在流感病毒致病机制、基因结构与功能的关系、疫苗研发等方面的研究中发挥重要作用。

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ESTABLISHMENT OF REVERSE GENETICS SYSTEM OF TRIPLEREASSORTANT H1N1 SUBTYPE SWINE INFLUENZA VIRUS

WANG Qi, LIU Xiao-min, YANG Hai-ming, WANG Shuai-yong, SHAN Tong-ling, TONG Wu, LI Guo-xin, TONG Guang-zhi, YU Hai

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The eight gene segments of triple-reassortant H1N1 subtype Swine influenza virus A/swine/Tianjin/10/2013(H1N1) were amplif ed in RT-PCR and individually cloned into the transcription/ expression vector pBD that was used to transfect 293T cells. The supernatant samples of transfected 293T cells were collected after 48 h and inoculated into MDCK cells. The rescued viruses was determined to Swine inf uenza virus in hemagglutination test. The full genome of the rescued virus was conf rmed no nucleic acid change as compared with the wild-type virus through sequence analysis. The measured results of growth curves showed no signif cant differences in virus titer between two strains. Therefore, it concluded that the virus was rescued successfully. The establishment of reverse genetic system of H1N1 subtype Swine inf uenza virus settles the foundation for future research on biological characteristics and production of recombinant inf uenza vaccine of H1N1 swine inf uenza.

Swine inf uenza virus; H1N1; reverse genetics; virus rescue

S852.659.5

A

1674-6422（2017）03-0028-06

2016-11-18

上海市自然科学基金青年项目（16ZR1444000）；中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（2015JB07）；闵行领军人才队伍建设专项资金；中国农业科学院创新工程“猪病毒性繁殖障碍综合症团队”项目

汪琪，女，硕士研究生，预防兽医学专业

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn；于海，E-mail：haiyu@shvri.ac.cn