紫花苜蓿幼苗生长及其叶片形态对水分胁迫的响应

李 跃， 毕舒贻， 万修福， 曹 婧， 栗振义， 万里强， 李向林

( 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所， 北京 100193)

近年来，随着草牧业的大力发展，我国紫花苜蓿(MedicagosativaL.)的种植面积在不断扩大[1]，然而种植苜蓿需要大量水源灌溉，我国又是水资源紧缺国家，加之全球气候变暖的事实，研究紫花苜蓿对干旱的响应，为提高苜蓿耐旱性具有重要意义。水分胁迫下，可以通过测量紫花苜蓿在叶片形态、根系特征、生理生化以及分子层面上发生的改变来衡量其耐旱性。在形态学方面，苜蓿的耐旱性更倾向于用根冠比、叶面积、相对含水量以及比叶面积等指标来衡量[2-3]，这与小麦(TriticumaestivumL.)和棉花(Gossypiumspp)等作物以干重产量来衡量抗旱性不同[4-6]。原因是紫花苜蓿与小麦等作物在生长特性和利用方式上都有极大的差异。紫花苜蓿是多年生植物，因此在进行抗旱评价时不仅要考虑产量，还要考虑其生长的持久性，根冠比增大有利于苜蓿的持续生长和提高存活率。小麦等粮食作物多为一年生，因此无需考虑其生产性能的持久性。另外，小麦等作物收获的是种子，而苜蓿的收获物是营养体，因此在进行抗旱评价时要着重考虑营养体的形态响应。根据翟春梅[2]对21个紫花苜蓿品种进行的抗旱评价研究表明，叶长、叶宽、根冠比胁迫指数等指标可作为紫花苜蓿抗旱鉴定的综合评价指标。水分胁迫下紫花苜蓿地下与地上生物量分配的变化，即根冠比的变化，可反映品种抗旱性的强弱[2]。根冠比升高有助于维持植物体内水分平衡，使其度过胁迫时期，保证个体的存活。植物器官中叶片对干旱最为敏感[7]，水分胁迫下叶片形态的变化也是植物对缺水环境适应的结果。一般而言，植物叶片越短、越窄，水分散失越少，抗旱能力越强[2,8]。比叶面积是用来表征植物叶片厚度的一个指标，被认为可能是指示紫花苜蓿抗旱性的重要指标[9]。水分胁迫下比叶面积会发生变化，且具有物种特异性，即不同物种的比叶面积在水分胁迫下的变化趋势可能不同[10]。在其他植物上的研究结果表明，干旱胁迫下比叶面积越小的品种耐旱性越强[10]，因为在同化产物，即干物质相同的情况下，叶面积越小，水分散失也越小。叶片保水力也与植物抗旱性密切相关，叶片保水力强，植物的抗旱能力一般也较强。植物叶水势变化和叶片相对含水量的变化在一定程度上可以表征叶片的保水能力[8]。

目前，有关紫花苜蓿形态对水分胁迫响应的研究较多，如张曦等[2]研究了不同生育时期陇东苜蓿叶性状对干旱的响应；赵大华和温智鹏[11]研究了干旱胁迫对正道苜蓿幼苗生长的影响，考察了生物量、叶片形态及气孔特征等指标。然而，以上研究都只是针对单一的紫花苜蓿品种进行的考察。李文娆等[12]研究了‘陇东’和‘阿尔冈金’两个紫花苜蓿品种对水分胁迫的响应，但仅对根系形态进行了研究。翟春梅[1]虽然对多个品种进行了抗旱性研究，但是只设置了正常供水(最大田间持水量的75%～80%)和水分胁迫(最大田间持水量的40%～45%)两组处理，难以阐明紫花苜蓿对水分胁迫的动态响应。本研究考察了3个紫花苜蓿品种的生长和叶片形态学特征对轻度、中度和重度水分胁迫的响应。对3个遗传差异较大的紫花苜蓿品种，即‘敖汉’、‘中苜 1号’和‘三得利’，进行了不同程度的水分胁迫处理，并测量了根冠比、比叶面积等多个形态学指标。本研究旨在探究不同品种紫花苜蓿的形态学特征对水分胁迫的差异响应，同时确定参试紫花苜蓿品种的抗旱性差异，为下一步研究苜蓿耐旱机理奠定基础。

1 试验材料与方法

1.1 紫花苜蓿品种及其培养

选取饱满的紫花苜蓿种子，经75%乙醇和次氯酸钠消毒后，置于培养皿内的湿润滤纸上催芽。种子发芽后，将其移植到高20 cm，直径15 cm的花盆中，每盆20株。培养基质为营养土：泥炭(1:1，V/V)。盆栽置于中国农业科学院廊坊试验基地日光温室中培养，自然光照，温度控制在25℃。种子移栽4周后，间除弱小的幼苗，留10株健壮且长势一致的幼苗。继续培养4周后，对分枝期苜蓿植株进行干旱胁迫处理。

1.2 试验设计

试验设置了4个水分胁迫梯度，即充分供水(CK)，85%田间持水量；轻度水分胁迫(LS)，65%田间持水量；中度水分胁迫(MS)，45%田间持水量；重度水分胁迫(SS)，25%田间持水量。采用称重法控制不同干旱处理盆栽内的含水量，每个品种的每个处理重复3次，干旱处理2周后，同时进行取样和各项指标的测量。

1.3 指标测量

1.3.1叶片水势和相对含水量的测量 叶片相对含水量的测量采用Antolín等[13]的方法，将植株最顶端完全展开的叶片摘下，共摘取30片复叶，称重为W1；然后将叶片用湿润的纱布包裹复水30 min后称重为W2；最后将叶片用65℃烘箱烘干，称其干重为W3。叶片相对含水量(RWC)=(W2- W1)/(W2-W3)。叶水势测量采用psypro水势测量系统(Beijing Channel Scientific Instruments Co., Ltd.)，对不同水分胁迫处理的植株最顶端完全展开的叶片进行测量。

1.3.2叶长、叶宽和叶面积的测量 将苜蓿植株的所有叶片摘下，展平后用扫描仪扫描成图片，然后用Scion Image图像处理软件测量叶片的长度和宽度，测得复叶中间小叶的长度为叶长，测得复叶中间小叶的最宽处为叶宽，用Photoshop软件测量叶面积[14]。

1.3.3比叶面积的计算 比叶面积=叶面积/叶干重。

1.3.4叶干重、茎干重和根干重的测量 将紫花苜蓿叶片、茎秆和根系分别收获，称重后装入牛皮纸袋中，于110℃杀青0.5 h之后，在65℃烘箱中烘干48 h至恒重。

1.3.5胁迫指数的计算 试验测量的胁迫指数包括根系含水量胁迫指数、叶片含水量胁迫指数以及比叶面积胁迫指数。胁迫指数=胁迫植株的测量值/对照植株的测量值[1]。

1.4 数据分析

用SAS 9.0软件进行处理间和品种间的差异显著性分析，用Microsoft office EXCEL软件进行相关绘图。

2 结果与分析

2.1 水分胁迫对紫花苜蓿生物量的影响

不同苜蓿品种的生物量对水分胁迫的响应不同。如图1所示，随着水分胁迫程度的增大，参试的3个品种的茎干重呈下降趋势；‘敖汉’和‘中苜1号’的根干重变化不明显，‘三得利’的根干重呈先升高后下降的趋势；‘敖汉’和‘中苜1号’的叶干重呈下降趋势，‘三得利’的叶干重呈先升高后下降的趋势；‘敖汉’和‘中苜1号’的根冠比呈上升趋势，而‘三得利’的根冠比则先上升后下降。

与充分供水相比，轻度水分胁迫下‘三得利’的茎干重和叶干重变化不明显，‘中苜1号’和‘敖汉’的茎干重和叶干重显著下降(P<0.05)，茎干重分别下降了27.6%和32%，叶干重分别下降了29.6%和33.3%；‘三得利’的根干重显著升高，而‘中苜1号’和‘敖汉’的根干重无明显变化；3个品种紫花苜蓿的根冠比均显著升高(P<0.05)。对品种间进行差异显著性分析，结果显示：轻度水分胁迫下，‘三得利’的茎干重、根干重和叶干重最高，‘中苜1号’次之，‘敖汉’最低；3个品种的根冠比无明显差异。中度水分胁迫下，3个品种与对照的差异情况以及品种间的差异情况与轻度水分胁迫基本相同。

与充分供水相比，重度水分胁迫下‘三得利’的茎干重变化仍然无显著变化，叶干重下降显著，降低了33.3%，‘中苜1号’和‘敖汉’的茎干重和叶干重都显著降低，茎干重分别下降了27.6%和32%，叶干重分别下降了48.1%和54.2%。3个紫花苜蓿品种的根干重与各自的对照差异均不显著。‘中苜1号’和‘敖汉’的根冠比继续升高，分别达到对照的1.63倍和1.71倍，而‘三得利’的根冠比则开始下降。品种间的差异显著性分析显示：‘三得利’和‘中苜1号’之间的根干重和茎干重无明显差异，且二者的根干重和茎干重都高于‘敖汉’；3个品种间的叶干重无明显差异；‘敖汉’和‘中苜1号’的根冠比此时已经明显高于‘三得利’。

2.2 水分胁迫对紫花苜蓿水分状态的影响

由表1可知，随着水分胁迫程度增大，3个品种紫花苜蓿的叶水势均呈下降趋势；轻度水分胁迫下，‘中苜1号’紫花苜蓿的叶水势已经显著低于对照(P<0.05)，其他两个品种紫花苜蓿的叶水势与对照相差不显著。但总体而言，3个品种紫花苜蓿的叶水势变化比较相似，品种之间的差异并不明显。

表1 水分胁迫对紫花苜蓿叶片水势和相对含水量的影响Table 1 Effects of water stress on alfalfa leaf water potential and RWC

注：同列不同小写字母表示相同品种不同水分胁迫处理之间差异显著(P<0.05)，同行不同大写字母表示相同的水分处理下不同品种之间差异显著(P<0.05)

Note: The different lower case letters in the same column indicate significant differences between treatments of the same variety at the 0.05 level, and different uppercase letters indicate significant differences between varieties under the same treatment at the 0.05 level

轻度水分胁迫下，‘中苜1号’紫花苜蓿的叶片相对含水量显著低于对照(P<0.05)，其他两个品种与对照相差不显著，这一结果与叶水势的结果相似。‘敖汉’苜蓿的叶片相对含水量随着水分胁迫程度的增强并未出现显著的下降。品种间比较的结果显示：轻、中、重度水分胁迫下，‘敖汉’的相对含水量均显著高于‘中苜1号’和‘三得利’(P<0.05)。

图1 水分胁迫对紫花苜蓿生物量的影响Fig.1 Effects of water stress on alfalfa biomass注：不同小写字母表示相同品种不同水分胁迫处理之间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示相同的水分处理下不同品种之间的 差异显著(P<0.05)，下同Note: Different lowercase letters indicate significant difference between treatments of the same variety at the 0.05 level, and different uppercase letters indicate significant difference between varieties under the same treatment at the 0.05 level. The same as below

图2所示为不同水分胁迫处理下3个紫花苜蓿品种的根系和叶片含水量胁迫指数的变化情况。随着水分胁迫程度的增大，参试的3个品种的根系含水量胁迫指数均呈下降趋势。与充分供水相比，轻度水分胁迫下的‘敖汉’根系含水量胁迫指数无明显变化，其他两个品种则显著降低。中度和重度水分胁迫下3个品种的根系含水量胁迫指数均显著低于对照(P<0.05)。

3个紫花苜蓿品种的叶片含水量胁迫指数对水分胁迫的响应存在差异。轻度水分胁迫下，3个品种的叶片含水量胁迫指数变化不明显；中度水分胁迫下，‘敖汉’和‘三得利’的叶片含水量胁迫指数与对照差异依然不明显，‘中苜1号’则显著低于对照(P<0.05)；重度水分胁迫下，3个品种的叶片含水量胁迫指数均显著低于其他水分胁迫处理(P<0.05)。

图2 水分胁迫对紫花苜蓿叶片以及根系含水量胁迫 指数的影响Fig.2 Effects of water stress on alfalfa stress index of leaf water content and root water content

2.3 水分胁迫对紫花苜蓿叶片形态的影响

与生物量不同，3个品种紫花苜蓿的叶片形态对水分胁迫的响应比较一致。如图3所示，随着水分胁迫程度的增大，参试的3个品种的叶长、叶面积和比叶面积胁迫指数均呈下降趋势，叶宽也略有下降，但下降程度不大。与充分供水相比，水分胁迫下，‘敖汉’的叶长下降了16.5%～20.9%，‘中苜1号’的叶长下降了11.7%～19.0%，‘三得利’的叶长下降了10.1%～21.5%；‘敖汉’的叶面积下降了25.3%～29.5%，‘中苜1号’的叶面积下降了17.6%～22.9%，‘三得利’的叶面积下降了15.7%～34.8%；‘敖汉’的比叶面积胁迫指数下降了27%～41%，‘中苜1号’的比叶面积胁迫指数下降了20%～28%，‘三得利’的比叶面积胁迫指数下降了10%～20%。

品种间比较的结果显示：在对照、轻度和中度水分胁迫下，‘中苜1号’和‘三得利’的叶长和叶面积均显著高于‘敖汉’(P<0.05)。轻度水分胁迫下，‘敖汉’的比叶面积胁迫指数最低，其次是‘中苜1号’，‘三得利’最高。中度水分胁迫下，3个品种间的比叶面积胁迫指数差异不显著。重度胁迫下，‘敖汉’的比叶面积胁迫指数显著低于‘中苜1号’和‘三得利’(P<0.05)。

图3 水分胁迫对紫花苜蓿叶片形态的影响Fig.3 Effects of water stress on alfalfa leaf morphology

3 讨论

由本试验结果可知，水分胁迫对叶片的影响最大，其次是茎，对根的影响最小。不同紫花苜蓿品种的相同器官对水分胁迫的响应也不同。轻、中度水分胁迫下‘三得利’苜蓿的茎、叶干重的变化不大，甚至还增加了根干重，没有表现出御旱反应；‘敖汉’和‘中苜1号’的茎、叶干重变化较大，御旱反应明显。‘三得利’紫花苜蓿在轻、中度水分胁迫下的根干重高于对照，这一结果与赵大华等[11]的结果相同，即‘正道’紫花苜蓿在干旱胁迫下的地上生物量上升。但是在其他很多研究[9,12]中都发现干旱胁迫下紫花苜蓿的根干重是下降的，而这又和本试验在‘敖汉’和‘中苜1号’苜蓿上取得的结果是一致的。产生这两种结果的原因可能是不同紫花苜蓿品种对水分胁迫的响应模式存在差异。

3个品种紫花苜蓿的根冠比在充分供水状态下差异不显著，但是在重度水分胁迫下‘敖汉’和‘中苜1号’的根冠比显著高于‘三得利’。因此，从根冠比的变化来看，‘敖汉’和‘中苜1号’的御旱性较强，‘三得利’较弱。同时该结果也说明在水分胁迫并不严重时，品种间抗旱性的差异可能不会很显著，只有在胁迫达到一定程度时，品种间的抗旱性差异才可能显现。与本研究结果不同，Erice等[9]的结果显示不同品种紫花苜蓿的根冠比在轻度干旱胁迫下有的升高有的降低。这可能是由于干旱胁迫处理的方法造成的，Erice等[9]采用的是停水法，本研究采用的是称重控水法。

随着干旱胁迫程度增大，3个品种紫花苜蓿的叶水势和叶片相对含水量均呈下降趋势，但是‘敖汉’苜蓿的叶片相对含水量变化不明显，该结果可能是由品种的差异造成的。对品种间进行相对含水量的比较发现，水分胁迫下‘敖汉’的相对含水量总是最高的，其次是‘中苜1号’，最后是‘三得利’。根系和叶片含水量胁迫指数表示胁迫条件下根系和叶片的含水量相对于对照变化的幅度。轻、中度水分胁迫下，‘敖汉’的根系和叶片含水量胁迫指数最高，其次是‘三得利’，最后是‘中苜1号’；重度胁迫下，3个品种的根系含水量胁迫指数之间无显著差异，‘敖汉’和‘三得利’的叶片相对含水量较高，‘中苜1号’最低。3个品种的根系和叶片含水量胁迫指数的排序情况与相对含水量的排序情况略有不同，‘敖汉’仍然是保水力最强的，‘中苜1号’和‘三得利’位置互换，这可能是因为‘中苜1号’与‘三得利’的叶片保水力比较相近，不易区分。综合以上分析来看，‘敖汉’苜蓿的叶片保水力最强，‘中苜1号’和‘三得利’较弱。

水分胁迫下3个品种紫花苜蓿的叶片变短，叶面积变小。本研究中‘敖汉’苜蓿的叶面积最小，抗旱性强；‘中苜1号’和‘三得利’苜蓿的叶面积较大，抗旱性较弱。另外，该结果也说明水分胁迫下紫花苜蓿叶片的长度和叶面积的可塑性较强。本试验中‘中苜1号’的叶宽对水分胁迫没有明显响应，‘敖汉’和‘三得利’的叶宽显著降低。同时值得注意的是，轻度水分胁迫下，苜蓿叶片的水势和相对叶片含水量基本上都没有显著变化，但是叶长以及叶片面积均已显著下降，说明叶水势和相对含水量不是造成叶片变小的原因，而在轻度水分胁迫下，光合作用一般也不会受到显著影响[2]，所以可能是膨压变化导致了苜蓿叶片变小。

在充分供水条件下3个品种间的比叶面积差异较大，因此试验中采用比叶面积胁迫指数来表征其变化程度。在3个不同水平的水分胁迫下，相对于其他两个品种而言，‘敖汉’的比叶面积胁迫指数一直处于较低的水平，而‘三得利’一直处于较高的水平，‘中苜1号’居中。综合叶长、叶面积和比叶面积的结果来看，依然是‘敖汉’苜蓿御旱性最强，‘中苜1号’次之，‘三得利’最弱。

因此，通过分析根冠比和比叶面积等耐旱指标，‘敖汉’苜蓿是3个品种紫花苜蓿中最耐旱的，但是‘敖汉’的生物量最小，尤其是茎干重和根干重，这一结果和张曦等[3]的研究结果一致。由此可见，耐旱和产量通常是一对矛盾体，耐旱的植物往往是以牺牲产量为代价的，而生长过快也往往伴随着大量耗水。

4 结论

综上所述，根冠比和比叶面积可以作为筛选耐旱苜蓿品种的形态学指标。根据这两个指标可以看出，水分胁迫下‘敖汉’的御旱性最好，‘中苜1号’次之，‘三得利’苜蓿御旱性最差。但是抗旱性强的品种往往产量较低，因此生产上可以选择‘中苜1号’这种具有一定的耐旱性，同时产量又高的品种。