耐低氮烟草基因型的筛选及其氮效率类型

钟思荣陈仁霄陶 瑶龚丝雨何宽信张启明张世川刘齐元,*

1江西农业大学农学院 / 作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室 / 江西省作物生理生态与遗传育种重点实验室, 江西南昌330045;2江西省烟叶科学研究所, 江西南昌330045

耐低氮烟草基因型的筛选及其氮效率类型

钟思荣1陈仁霄2陶 瑶1龚丝雨1何宽信2张启明2张世川1刘齐元1,*

1江西农业大学农学院 / 作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室 / 江西省作物生理生态与遗传育种重点实验室, 江西南昌330045;2江西省烟叶科学研究所, 江西南昌330045

筛选耐低氮及氮高效的烟草基因型是提高氮素利用效率, 减少氮污染的一种有效途径。本文采用营养液培养方法,以低氮(0.5 mmol L–1)和正常氮(5.0 mmol L–1)处理74个烟草基因型幼苗, 通过指标统计、因子分析、聚类分析来确定评价指标, 并筛选出耐低氮基因型。不同基因型烟草的根系体积、根系生物量、茎叶氮累积量、地上部生物量变异明显, 低氮和正常氮处理的变异系数分别为0.37～0.68和0.38～0.64。两种氮水平下的主成分基本相似, 并表明茎叶氮累积量和地上部生物量起主要作用。根据评价指标的 Heatmap聚类和氮效率综合值散点图分析结果, 筛选出15个耐低氮基因型, 占供试材料的20.3%, 其中8个属于低氮高效正常氮低效型, 6个属于低氮低效正常氮低效型, 1个属于低氮高效正常氮高效型; 还筛选出8个低氮敏感基因型, 其中6个属于低氮低效正常氮高效型, 2个属于低氮低效正常氮低效型。初步确定14P9为耐低氮且氮高效基因型, 中烟100和K394为低氮敏感且氮低效基因型。

烟草; 基因型; 苗期; 氮素; 氮高效

氮素是影响烟草生长发育、产量及品质最重要的营养元素[1-2], 我国烟草种植面积位居世界前列, 但氮肥利用率低于世界平均水平[3], 农田氮肥的损失,不仅会降低农业经济效益, 还会造成氮污染[4], 制约农业可持续发展。不同基因型烟草的耐低氮能力及氮效率存在一定的差异[5], 通过选育高产优质的耐低氮烟草品种, 充分挖掘作物自身的基因潜力, 是提高氮素利用效率的一种有效途径。一般耐低氮作物在氮素养分浓度低时仍然具有保持正常生长的能力, 生物学产量与正常供氮条件下接近[6]。用低氮与正常氮条件下某些指标相对值表示其耐低氮能力, 可将品种分为耐低氮、中间型和低氮敏感3类。氮效率是指特定供氮条件下的作物产量, 可表示为同等供氮条件下吸氮量, 也可用单位吸收氮素所产生的干物质表示[7], 是品种间指标比较的绝对值, 在同一氮水平下可将品种分为氮高效和氮低效两类。评价作物耐低氮能力及氮效率的指标很多, 如SPAD值[8-9]、硝酸还原酶活性[10]、谷氨酸合成酶活性[11]、植株生物产量和含氮量[12]、地上部干物重和地上部吸氮量[13]等, 但至今还没有公认一致的。梁景霞等[14]以低氮下的相对生物量作为筛选指标对36个烟草材料耐低氮能力进行了评价; 杨中义等[15]研究了5个烟草品种的苗期根系,认为根数、总根长等可以作为苗期耐低氮的筛选指标。但以上研究采用的品种较少。目前对大量烟草基因型耐低氮筛选的报道较少, 且大部分研究仅考虑耐低氮性而不考虑自身氮效率, 不利于筛选出符合生产需要的耐低氮烟草基因型。

烟草是以收获叶片为主要目的的经济作物, 幼苗期氮素营养特性与大田期具有一致性[16], 依据苗期的氮素营养特征来反映该基因型的真实氮营养特性具有可行性。本文采用营养液培养及指标统计、因子分析和聚类热图分析, 旨在为耐低氮、氮高效烟草基因型的筛选提供方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

共74份烟草材料, 由国家农作物种质资源平台烟草种质资源子平台(山东青岛)提供47份。

1.2 试验方法

参考烟草[15]和棉花[17]的氮素研究处理, 根据前期预试验调整后确定处理浓度。采用漂浮育苗, 在完全营养液中培养至四叶一心时, 挑选同一品种长势一致的烟苗进行营养液培养, 设置低氮(0.5 mmol L–1N, 0.25 mmol L–1NH4NO3)和正常氮(5.0 mmol L–1N, 2.5 mmol L–1NH4NO3)处理, 其他营养成分浓度相同，分别是1.0 mmol L–1KH2PO4、2.4 mmol L–1K2SO4、5.0 mmol L–1CaCl2、2.0 mmol L–1MgSO4、3.7×10–2mmol L–1Fe-EDTA、4.6×10–2mmol L–1H3BO4、9.0 μmol L–1MnCl2、7.65×10–1μmol L–1ZnSO4、3.2×10–1μmol L–1CuSO4、1.6×10–2μmol L–1(NH4)6MO7O24。烟苗等间距定植, 重复3次, 每重复6株。采用母液稀释法配制水培营养液, 并将培养液pH调至6.0±0.1。培养中一周更换2次营养液, 并以充气泵连续通气。试验期间未见病虫害, 低氮和正常氮处理21 d后, 考察烟苗农艺性状。

1.3 调查项目及方法

采用便携式 SPAD-502叶绿素仪进行测量每个品种的烟草植株第2片完全展开叶SPAD值(叶绿素相对值), 每片叶测量10个点, 取平均值, 每个品种测量3株取平均值。在定植孔中取出处理后的烟苗,尽量保留完整的根系, 调查烟株的株高、茎粗、根体积, 每个材料重复 3次。用纱布擦干净表面后分别测定茎、叶的鲜重量。随机取每个品种的苗期 3株, 在茎基部切断, 分别在105℃下杀青30 min, 80℃下烘干至恒重, 冷却至室温后称量地上部及根系生物量取平均值。按文献[18]取烘干后的地上部粉碎,过60目筛, 称取0.5000 g粉末, 于消化管中, 加5 g混合催化剂(CuSO4∶K2SO4=1∶9)及10 mL浓H2SO4,轻摇混匀后消煮1 h, 用FOSS凯氏定氮仪测定氮含量。

茎叶氮积累量=茎叶生物量×茎叶氮含量

耐低氮指标相对值=低氮下性状测定值/正常氮性状测定值

1.4 氮效率综合值计算及分类方法

采用隶属函数法将评价指标计算为氮效率综合值[19-20]来代表不同供氮条件下不同基因型的氮素营养状况。公式为Yij= (Xij– Xjmin)/(Xjmax– Xjmin), 式中, Yij表示第i品种第j评价指标的氮效率隶属函数值; Xij表示第i品种第j评价指标的测定值; Xjmin、Xjmax分别表示第j评价指标的最小值和最大值。采用客观赋权法计算权重, 公式为Ej= Cj/∑Cj, 式中Ej表示j评价指标的权重; Cj表示第j评价指标的变异系数。氮效率综合值D = [∑(Yij× Ej)]/2。参考在谷子[21]、水稻[22]、甘蔗[23]上的分类方法划分苗期氮素营养类型。

1.5 数据分析方法

用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0统计分析,采用独立样本 t测验检验低氮与正常氮性状指标均值, 采用最大方差法正交旋转得出主成分因子。采用Heml 1.0 Heatmap Illustrator进行聚类热图分析,用Origin7.5绘制散点图。

2 结果与分析

2.1 烟草苗期主要农艺性状

表1表明, SPAD值、茎叶氮素含量、地上部生物量、茎叶氮累积量、叶鲜重、茎鲜重、株高、茎粗的极值和均值在低氮胁迫条件下均显著低于正常氮条件下, 并且在低氮条件下植株大小以及叶片黄化程度不同, 说明苗期以0.5 mmol L–1氮浓度作为低氮胁迫的筛选压力是合理的。不同供氮条件下各指标的均值比最大的是茎叶氮累积量,其次是茎鲜重和地上部生物量, 均值比分别为2.39、1.94和1.72, 说明茎叶氮累积量、茎鲜重和地上部生物量在不同供氮条件下差异较大。而根系体积在低氮胁迫下极值和均值大于正常氮水平下, 均值是正常供氮下的 1.26倍, 根系生物量的极值和均值在不同供氮条件下比较相近, 表明在氮素胁迫下烟苗容易形成更大的根系。在低氮胁迫下, 变异系数为根系体积＞根系生物量＞茎鲜重＞茎叶氮积累量＞地上部生物量＞株高＞叶鲜重＞茎叶氮素含量＞茎粗＞SPAD值, 变异系数范围为0.11～0.68,表明在低氮胁迫下, 根系体积、根系生物量、茎鲜重、茎叶氮积累量、地上部生物量等指标灵敏度高,有利于不同基因型差异的显示。正常供氮条件下变异系数为根系体积＞根系生物量＞茎叶氮累积量＞地上部生物量＞茎鲜重＞株高＞茎粗＞SPAD值＞茎叶氮素含量, 变异系数范围为 0.09～0.64, 表明根系体积、根系生物量、茎叶氮累积量、地上部生物量在正常氮条件下灵敏度高, 基本与低氮条件下类似。初步说明根系体积、根系生物量、茎叶氮累积量、地上部生物量可以作为不同基因型烟草耐低氮的筛选指标。

2.2 烟草主要农艺性状因子分析

表2显示, 在低氮条件下可以提取3个主成分,总解释方差为79.096%, 第1主成分的方差贡献率为48.002%, 第 2、第 3主成分方差贡献率分别为19.620%和11.474%, 第1主成分主要由茎叶氮积累量、地上部生物量、叶鲜重、茎鲜重、茎粗决定。在正常氮条件下可以提取 2个主成分, 总解释方差为72.481%, 第1主成分方差贡献率为58.066%, 第2主成分为14.414%, 第1主成分主要由茎叶氮累积量、地上部生物量、茎粗、根体积、叶鲜重、茎鲜重、根干重决定。根据各主成分的贡献率情况, 说明在不同供氮条件下茎叶氮累积量和地上部生物量最能代表不同基因型烟草对氮素的响应状况。

2.3 耐低氮烟草基因型的筛选

根据烟草苗期性状指标的描述统计和因子分析结果, 确定茎叶氮累积量和地上部生物量作为烟草苗期耐低氮评价指标。通过对不同基因型烟草在低氮和正常氮条件下的地上部生物量和茎叶氮累积量的相对值分析(表3), 地上部生物量相对值的变幅为0.19～0.98, 均值为0.60, 其中K394地上部生物量相对值最小, 为 0.19, Ti245地上部生物量相对值最大,为0.98。茎叶氮累积量相对值的变幅为0.15～1.01, 均值0.45, 其中K394茎叶氮累积量相对值最小, 为0.15, Oxford 2028茎叶氮累积量相对值最大, 为1.01。

以地上部生物量和茎叶氮累积量的相对值作为指标, 采用平方欧式距离法对 74个烟草基因型进行聚类热图分析, 用颜色变化梯度可以直观地反映数据的大小及差异(图1)。经过分析可知, 地上部生物量相对值普遍大于茎叶氮累积量相对值; 3个基因型96019、Oxford 2028和MSKCH1的2个相对值均较大。由聚类分析结果可以将不同基因型分成5类, 第I类8个品种(分别为Coker 176、岩烟97、云烟317、CV87、NordelB、CB1、K394和中烟 100)表现为地上部相对生物量和茎叶氮相对累积量均较小; 第II类3个品种(96019、Oxford 2028、MSKCH1)表现为地上部相对生物量和茎叶氮相对累积量均较大; 第 III类 12个品种(编号分别为Coker 347、云烟105、云烟2号、鲁烟2号、Ti245、HY06、14P4、14P18、C151、14P9、14P10和云烟98)表现为地上部相对生物量较大茎叶氮相对累积量中等; 第IV类9个品种(安选4号、闽烟3号、中烟98、86-3002、云选2号、14P5、净叶黄、单育2号和K346)表现为地上部相对生物量中等茎叶氮相对累积量较小; 第V类42个品种(除前4类外的其他品种)表现为地上部相对生物量和茎叶氮相对累积量均中等。综合分析, 第I类8个基因型属于低氮敏感品种, 第II类和第III类共15个基因型属于耐低氮品种。

表2 方差极大正交旋转因子载荷矩阵Table 2 Loading matrix of varimax rotation factors

表3 不同供氮条件下烟草苗期地上部生物量和茎叶氮积累量相对值Table 3 Relative values of aboveground biomass and stalk leaf nitrogen accumulation under different nitrogen levels at seedling stage

图1 不同基因型烟草指标相对值聚类图Fig. 1 Heatmap clustering for relative indicatiors in different tobacco genotypes

2.4 不同供氮条件下烟草苗期氮效率综合值分析

以茎叶氮累积量和地上部生物量作为烟草苗期氮效率评价指标, 通过隶属函数综合分析, 复合运算得到不同基因型在低氮和正常氮条件下的氮效率综合值来评价不同基因型烟草氮效率的优劣。由表4可知, 在低氮条件下, 氮效率综合值均值为0.199,其中MSB47最小, 为0.01, 14P9最大, 为0.49。在正常供氮条件下, 氮效率综合值均值为 0.192, 其中Ti245最小, 为0.01, Coker 176最大, 为0.50。

利用不同烟草基因型在低氮和正常供氮条件下的氮效率综合值进行散点作图, 并将不同基因型分成4类(图2), 即低氮低效正常氮高效型(类型I), 低氮高效正常氮高效型(类型 II), 低氮低效正常氮低效型(类型III), 低氮高效正常氮低效型(类型IV)。其中类型III烟草品种较多, 占 60.8%, 类型 IV其次,占 16.2%, 类型 I、类型 II烟草品种较少, 分别占12.2%和 10.8%。前述聚类分析结果中的 15个耐低氮品种有8个属于低氮高效正常氮低效型, 占53.3%, 6个属于低氮低效正常氮低效型, 占 40.0%, 只有14P9属于低氮高效正常氮高效型, 占0.7%; 8个低氮敏感品种中有 6个属于低氮低效正常氮高效型,占75%, 2个品种中烟100和K394属于低氮低效正常氮低效型, 占25.0%。初步得出14P9属于耐低氮、氮高效基因型, 中烟100和K394属于低氮敏感、氮低效基因型。

表4 不同供氮条件下烟草苗期氮效率综合值Table 4 Nitrogen efficiency comprehensive value under different nitrogen levels at seedling stage of tobacco

图2 不同供氮水平下不同基因型烟草氮效率综合值散点图Fig. 2 Scatter map of nitrogen efficiency comprehensive value in tobacco genotypes under different nitrogen levels第I、III类包括LN氮效率综合值0.25; 第III、IV类包括NN氮效率综合值0.25。I, III classes include LN nitrogen efficiency comprehensive value of 0.25; III, IV classes include NN nitrogen efficiency comprehensive value of 0.25. 1: Anxuan 4; 2: Minyan 3; 3: Yunxuan 2; 4: Dabaijin 599; 5: Gexin 3; 6: Danyu 2; 7: Jingyehuang; 8: Chunlei 3; 9: Coker 347; 10: DB101; 11: NC95; 12: G28; 13: Ti245; 14: Ti448A; 15: 86-3002; 16: Yongding 1; 17: Yunyan 2; 18: Coker176; 19: K326; 20: K394; 21: K399; 22: NC82; 23: NC567; 24: G80; 25: Taiyan 7; 26: Zhongyan 90; 27: CV87; 28: Yunhua 1; 29: Longyan C2; 30: Coker 139; 31: Zhongyan 98; 32: Zhongyan 100; 33: G80B; 34: Yanyan 97; 35: C151; 36: 96019; 37: K346; 38: Oxford 2028; 39: RG11; 40: RG17; 41: Yunyan 317; 42: CV70; 43: Kang 88; 44: Zhongyan 104; 45: Zhongyan 101; 46: Luyan 2; 47: ZC01; 48: 14P4; 49: 14P5; 50: 14P9; 51: Yunyan 87; 52: 14P13; 53: 14P14; 54: CB1; 55: 14P11; 56: Honghuadajinyuan; 57: 14P10; 58: 14P18; 59: NX326; 60: HY06; 61: MSB25; 62: MSB47; 63: MSB31; 64: MS39; 65: MSB52; 66: MSB44; 67: MSB58; 68: NordelB; 69: MSKCH1; 70: Yunyan 97; 71: Yunyan 98; 72: Yunyan 99; 73: Yunyan 105; 74: FL57.

3 讨论

20世纪30年代Harvey首次报道不同玉米品种在氮素营养上存在差异[24], 至今对不同基因型氮高效利用的研究已经在许多农作物上展开, 如水稻[25]、小麦[26]、玉米[27]、黄瓜[28]等。氮高效的作物品种主要从耐低氮性和高氮效率等方面选育。本文研究了74个烟草基因型在低氮和正常供氮条件下对氮素的响应状况, 与正常供氮相比, 低氮条件下的根系体积均值更大, 根系生物量则较接近, 可能是有些基因型在低氮胁迫下较多的光合产物被根系利用, 从而形成较大根系[29]; 但低氮条件下的茎叶氮累积量、茎鲜重和地上部生物量的均值明显低于正常供氮条件下, 表明低氮会抑制植株地上部的生长[30], 氮浓度提高对地上部的促进作用明显, 且容易累积较大比例的氮素, 这与王艳等[31]的研究结果相似。低氮条件下的根系体积均值较大, 但茎叶氮累积量较少,说明氮素累积量不仅依赖根系大小, 也与氮素吸收速率有关[32]。不同供氮条件下根系体积、根系生物量、茎叶氮累积量、地上部生物量的变异系数均较大, 表明这 4个指标能较好地体现不同基因型之间的差异, 而SPAD值、茎叶氮素含量、茎粗的变异系数最小, 说明这些指标对氮素的响应在基因型的差异上不敏感, 这与梁景霞等[3]的研究结果一致。因子分析结果表明, 茎叶氮累积量和地上部生物量在主成分中占较大比重, 因此将茎叶氮累积量和地上部生物量作为耐低氮及氮高效的筛选指标是适合的,这在小麦[33-34]、玉米[35]、水稻[36]等作物上也得到了证实。通过对筛选指标的相对值进行聚类热图分析和综合值散点图分析, 筛选出14P9为耐低氮、氮高效基因型, 中烟100和K394为低氮敏感、氮低效基因型, 为进一步了解不同烟草基因型氮素高效利用的生理机制及分子生物学的研究提供了材料。烟草耐贫瘠性与耐肥性农艺性状表现相反[3], 即低氮敏感品种具有较强耐肥性。试验结果表明中烟 100对低氮敏感, 且氮效率较低与黄元炯等[5]在大田和盆栽的结果一致, 且与其在生产上较耐肥水、需重施基肥、早追肥的栽培特性一致[37]; K394在生产上也耐肥水, 且品种适应性较弱[38], 与其试验对低氮敏感、氮效率较低情况相符。14P9并非主栽品种, 其田间生产特性需进一步了解。

许多耐低氮的研究只考虑作物基因型对低氮的耐性, 没有结合基因型自身氮效率的优劣综合分析,容易筛选出耐低氮能力强, 但在低氮和正常氮条件下氮效率均较低的基因型, 这显然不是氮营养高效基因型。而本实验研究的烟草基因型较多且有部分国外引进品种, 将基因型耐低氮能力与自身氮效率相结合分析, 有利于客观评价各基因型的氮素营养状况。

4 结论

在低氮和正常氮培养下, 以茎叶氮累积量和地上部生物量作为耐低氮和氮效率的评价指标比较合适; 依据指标相对值聚类热图和氮效率综合值的散点图筛选出14P9为耐低氮、氮高效基因型, 中烟100和K394为低氮敏感、氮低效基因型。

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Screening of Tobacco Genotypes Tolerant to Low-Nitrogen and Their Nitrogen Efficiency Types

ZHONG Si-Rong1, CHEN Ren-Xiao2, TAO Yao1, GONG Si-Yu1, HE Kuan-Xin2, ZHANG Qi-Ming2, ZHANG Shi-Chuan1, and LIU Qi-Yuan1,*

1Key Laboratory of Crop Physiology, Ecology and Genetic Breeding, Ministry of Education / Key Laboratory of Crop Physiology, Ecology and Genetic Breeding of Jiangxi Province / College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China;2Jiangxi Leaf Tobacco Research Institute, Nanchang 330045, China

Genotypes with tolerance to low nitrogen (N) are preferred in improving N use efficiency of tobacco and reduce nitrogen pollution. In this study, seedlings of 74 tobacco genotypes were evaluated in a hydroponic experiment with low-N (0.5 mmol L–1) and normal-N (5.0 mmol L–1) treatments, and the genotypes were evaluated according to descriptive statistics, factor analysis and cluster analysis. The root volume, root biomass, N accumulation in stalk and leaf, and aboveground biomass varied greatly across genotypes with the variation coefficients of 0.37–0.68 in low-N treatment and 0.38–0.64 in normal-N treatment. The principal components under both N levels were similar, showing that the N accumulation in stalk and leaf and aboveground biomass were important components. According to evaluation indexes Heatmap clustering and scatter diagram analysis of N efficiency comprehensive value, 15 low-N tolerant genotypes were screened out, accounting for 20.3% of varieties tested, including eight genotypes of high-efficiency under low-N but low-efficiency under normal-N, six genotypes of low-efficiency under both low-N and normal-N, and one genotype of high-efficiency under both low-N and normal-N. In addition, eight genotypes were found to be sensitive to low-N, including six genotypes of low-efficiency under low-N but high-efficiency under normal-N and two genotypes of low-efficiency under both low-N and normal-N. We primarily identified 14P9 as the low-N tolerant and N-efficient tobacco and Zhongyan 100 and K394 as the low-N sensitive and N-inefficient tobacco.

Tobacco; Genotype; Seedling stage; Nitrogen; High nitrogen efficiency

(

): 2016-11-09; Accepted(接受日期): 2017-01-21; Published online(网络出版日期): 2017-02-17.

10.3724/SP.J.1006.2017.00993

本研究由江西省烟草专卖局科技项目(201401001)资助。

This study was supported by the Jiangxi Provincial Tobacco Monopoly Bureau of Science and Technology Project (201401001).*

刘齐元, E-mail: qiyuanl@126.com

联系方式: E-mail: 281720102@qq.com

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.1001.010.html